MOČOVINOVÝ VÝVAR: ZALOŽENIE, PRÍPRAVA A POUŽITIE - BIOLÓGIE - 2026

Močovina vývar je kvapalné kultivačné médium, ktorý sa používa na detekciu prítomnosti enzýmu ureázy v určitých mikroorganizmov. Močovina je mikrobiálny enzým, ktorý sa vytvára konštitutívnym spôsobom, to znamená, že sa syntetizuje bez ohľadu na to, či je alebo nie je prítomný substrát, na ktorý pôsobí.

Funkcia ureázy súvisí s rozkladom organických zlúčenín. Nie všetky mikroorganizmy sú schopné syntetizovať tento enzým, a preto jeho stanovenie v laboratóriu umožňuje identifikáciu určitých bakteriálnych kmeňov a dokonca rozlíšenie medzi druhmi rovnakého rodu.

Negatívny a pozitívny test na močovinu. Zdroj: Fotografia zhotovená autorom MSc. Marielsa Gil.

Existujú dva typy testu na močovinu: Stuart a Christensen. Líšia sa zložením a citlivosťou. Prvá je špeciálna na zobrazenie veľkého množstva ureázy produkovanej druhmi rodu Proteus.

Druhá je citlivejšia a môže detekovať malé množstvá ureázy generovanej neskoro inými bakteriálnymi rodmi, ako sú Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter a Mycobacterium.

Stuartov močovinový vývar sa skladá z močoviny, chloridu sodného, ​​fosforečnanu draselného, ​​fosforečnanu draselného, ​​extraktu z kvasiniek, fenolovej červene a destilovanej vody.

Medzitým je Christensenov močovinový vývar alebo agar zložený z peptonov, chloridu sodného, ​​fosforečnanu draselného, ​​glukózy, močoviny, fenolovej červene, destilovanej vody a agaru. Posledne menované iba vtedy, ak ide o pevné médium.

základ

Enzým ureáza hydrolyzuje močovinu na oxid uhličitý, vodu a dve molekuly amoniaku. Tieto zlúčeniny reagujú za vzniku konečného produktu nazývaného uhličitan amónny.

Stuartov močovinový vývar

Stuartov močovinový bujón je pufrovaný na pH 6,8. Mikroorganizmus musí preto byť schopný vytvárať veľké množstvo amoniaku, aby sa zmenila na fenolovú červenú. PH by malo stúpnuť nad 8.

Preto je Stuartov močovinový vývar selektívny pre druhy Proteus, čo vedie k pozitívnym výsledkom do 24 až 48 hodín inkubácie a nie je účinný pre baktérie, ktoré produkujú malé množstvo ureázy alebo ktoré pomaly hydrolyzujú močovinu.

Dôvodom je skutočnosť, že druhy Proteus dokážu použiť močovinu ako zdroj dusíka. Namiesto toho iné baktérie produkujúce ureázu potrebujú ďalší zdroj.

Pérez a kol. (2002) určili, že Stuartov močovinový vývar bol rovnako účinný ako Christensenov močovinový agar na stanovenie ureázy v kvasinkových kmeňoch rodov Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon a Saccharomyces.

Autori štúdie tvrdia, že pri inkubácii 24 a 48 hodín dosiahli 100% súhlas s oboma médiami (Stuart a Christensen); s výnimkou toho, že kmene, ktoré dokázali zmeniť médium na silnú ružovkastočervenú farbu, sa považovali za pozitívne.

Toto objasnenie je potrebné, pretože Lodder (1970) uviedol, že takmer všetky droždie dokážu zužovať agar Christensenovej močoviny na svetloružovú. Dôvodom je skutočnosť, že môžu hydrolyzovať močovinu v minimálnom množstve a tvorbu amínov oxidačnou dekarboxyláciou aminokyselín na povrchu. Toto by sa nemalo interpretovať ako pozitívne.

Christensenov močovinový agar alebo vývar

Christensenov močovinový vývar alebo agar je menej pufrovaný a je schopný zistiť malé množstvá amoniaku. Ďalej je toto médium obohatené o peptony a glukózu. Tieto zlúčeniny spôsobujú rast ďalších mikroorganizmov produkujúcich ureu, ktoré nerastú v pôde Stuart.

Podobne, test Christensenovej močoviny ponúka rýchlejšie výsledky, najmä pri proteíne Proteus, ktorý je schopný dať silne pozitívny výsledok za 30 minút ako minimálny čas a do 6 hodín ako maximálny čas.

Zvyšok mikroorganizmov produkujúcich ureu dokáže farbu média mierne zmeniť po 6 hodinách a silne po 24, 48, 72 hodinách alebo viac a dokonca aj niektoré kmene môžu po 5 alebo 6 dňoch vyvolať slabé reakcie.

Tlmočenie oboch médií (Stuart a Christensen)

Médium má pôvodne žltooranžovú farbu a pozitívna reakcia zmení farbu média na ružovkastočervenú. Intenzita farby je priamo úmerná množstvu vyrobeného amoniaku.

Negatívna reakcia zanechá médium pôvodnej farby s výnimkou kvasiniek, ktoré môžu na Christensenovom agare s močovinovým agarom bledne ružové.

príprava

Stuartov močovinový vývar

Odvážte potrebné gramy podľa údajov obchodnej spoločnosti. Rozpustite prednostne v sterilnej destilovanej vode. Na rozpustenie nepoužívajte teplo, pretože močovina je citlivá na teplo.

Na sterilizáciu sa používa membránová filtrácia. Na tento účel sa použije filter Millipore s pórmi s priemerom 0,45 um. Nepoužívajte autokláv. Po filtrácii sa roztok rozdelí do sterilných skúmaviek. Aby sa dosiahli spoľahlivé výsledky, mal by sa preniesť medzi 1,5 ml ako minimálne množstvo a 3 ml ako maximálne množstvo na skúmavku.

Pred použitím uchovávajte v chladničke a zohrejte.

Ak metóda filtrácie nie je k dispozícii, médium by sa malo použiť okamžite, aby sa získali spoľahlivé výsledky.

Ďalší spôsob, ako pripraviť Stuartov močovinový vývar, je nasledujúci:

Niektoré komerčné domy predávajú základné médium na močovinový test, okrem močoviny.

Váži sa množstvo uvedené obchodnou spoločnosťou. Rozpustí sa v destilovanej vode a sterilizuje sa v autokláve pri 121 ° C počas 15 minút. Nechá sa trochu odpočívať a keď je médium teplé, pridá sa 100 ml roztoku močoviny pripraveného pri 20% a sterilizuje sa filtráciou.

Je distribuovaný v sterilných skúmavkách, ako už bolo opísané.

Christensenov močovinový agar alebo vývar

- Príprava roztoku močoviny

Navážte 29 g dehydratovanej močoviny a rozpustite v 100 ml destilovanej vody. Na sterilizáciu použite metódu filtrácie. Nečakujte v autokláve.

-Použitý základný agar

24 g dehydratovaného základného agaru sa rozpustí v 950 ml destilovanej vody. Sterilizujte v autokláve pri 121 ° C po dobu 15 minút. Nechá sa stáť, kým nedosiahne teplotu 50 ° C a asepticky sa pridá predtým pripravená močovina.

Nalejte 4-5 ml do sterilných skúmaviek a nakláňajte, kým nezmiznú. Mal by existovať dlhý zobák na flautu.

Toto médium sa môže tiež pripraviť v kvapalnej forme.

aplikácia

Test na močovinu je mimoriadne účinný pri odlíšení rodu Proteus od ostatných rodov v rodine Enterobacteriaceae, vzhľadom na rýchlu reakciu, ktorú poskytuje Proteus.

Použitím Christensenovej kompozície pomáha test rozlišovať medzi druhmi rovnakého rodu. Napríklad S. haemolyticus a S. warneri sú koaguláza-negatívny a beta-hemolytický Staphylococcus, ale líšia sa tým, že S. haemolyticus je močovina negatívna a S. warneri je močovina pozitívna.

Na druhej strane McNulty úspešne použil Christensenov 2% močovinový bujón na štúdium prítomnosti Helicobacter pylori vo vzorkách biopsie odobratých z žalúdočnej sliznice (antrálna oblasť).

O prítomnosti H. pylori svedčí pozitívny test na močovinu. Čas na pozorovanie výsledkov je priamo úmerný množstvu prítomných mikroorganizmov.

Ako je zrejmé, ide o jednoduchý spôsob diagnostikovania Helicobacter pylori v žalúdočných biopsiách.

Nakoniec je tento test užitočný aj na odlíšenie druhov od rodov Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus a Mycobacteria.

Výsev močovej skúšky

Obidve metódy vyžadujú na optimalizáciu výsledkov silné mikrobiálne inokulum. Bakteriálne kolónie sa výhodne odoberajú z krvného agaru a kvasinky z agaru Sabouraud, až na pár výnimiek. Inokulum je emulgované v kvapalnom médiu.

Pre Stuartov močovinový vývar inkubujte pri teplote 37 ° C počas 24 až 48 hodín s vedomím, že hľadáte kmene rodu Proteus iba v prípade, že ide o baktériu. V prípade droždia sa môže inkubovať pri 37 ° C alebo pri teplote miestnosti počas 24 až 48 hodín inkubácie.

V prípade Christensenovho močovinového bujónu sa inkubuje 24 hodín pri 37 ° C. Ak je test negatívny, môže sa inkubovať až 6 dní. Ak je test pozitívny pred 6 hodinami, znamená to, že ide o kmeň rodu Proteus.

V prípade Christensenovho močovinového agaru je šikmý agar silne naočkovaný bez prepichnutia. Vývar sa inkubuje a interpretuje rovnakým spôsobom.

QA

Na testovanie média sa môžu použiť kontrolné kmene, ako napríklad Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 a Salmonella typhimurium. Prvé dva by mali dať pozitívne výsledky a posledné dva negatívne výsledky.

Zdroj: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vydanie. Editorial Panamericana SA Argentína.

Referencie

1. Pérez C, Goitía K., Mata S, Hartung C, Colella M, Reyes H. a kol. Použitie Stuartovho močovinového bujónu na ureázový test ako test na diagnostiku kvasiniek. Soc. Ven. Microbiol. 2002; 22 (2): 136 - 140. K dispozícii na: Scielo.org.
2. Mac Faddin J. (2003). Biochemické testy na identifikáciu baktérií klinického významu. 3. vydanie. Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentína.
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentína.
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vydanie. Editorial Panamericana SA Argentína.
5. Britannia Laboratories. Christensen Medium (základňa pre močovinový agar) 2015. Dostupné na: britanialab.com