FOSFÁTOVÝ PUFOR (PBS): ODÔVODNENIE, PRÍPRAVA A POUŽITIE - BIOLÓGIE - 2025

Fosfátový pufer, fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanom alebo BPS je vyrovnávacia pamäť, izotonický, ktorého úlohou je , aby sa hodnota pH udržala a osmotický tlak ako blízko k prirodzené biologické prostredie (fyziologický). Skratka PBS znamená fosfátový pufor.

PH a osmolarita sú dva veľmi dôležité aspekty, ktoré sa musia kontrolovať v určitých laboratórnych protokoloch. V prípade pH je nevyhnutné, aby bolo kontrolované, najmä pri biochemických reakciách, pretože tieto reakcie sa môžu meniť alebo nemusia byť uskutočňované, ak sú reaktanty v nevhodnom pH.

PBS fosfátový tlmivý roztok pri dvoch rôznych pH. Zdroj: Pixinio.com

Medzitým je kontrola osmolarity nevyhnutná najmä pri práci so živými bunkami, pretože plazmové membrány buniek reagujú podľa koncentrácie rozpustených látok, v ktorých sa nachádzajú.

Ak sa bunky prenesú do hypertonického média, dehydratujú sa, pretože gradient vody sa prenesie na stranu, kde je vyššia koncentrácia rozpustených látok. Ak sa naopak bunky umiestnia do hypotonického média, bunky absorbujú tekutinu, kým nie sú lyzované.

Preto sa PBS pufor používa pre laboratórne protokoly, ktoré vyžadujú udržiavanie buniek in vitro, čím sa bunky nepoškodia.

PBS je tvorený kombináciou solí, ako je chlorid sodný, fosforečnan sodný, chlorid draselný a fosforečnan draselný. Zloženie PBS sa môže meniť v závislosti od protokolu.

základ

Funkciou fosfátového pufra je v zásade udržiavať konštantné fyziologické pH spolu s koncentráciou elektrolytu, ktorá sa nachádza vo vnútri tela.

V tomto prostredí sú bunky schopné zostať stabilné, pretože fyziologické podmienky sú simulované čo najviac.

K pôvodnej formulácii PBS sa môžu v prípade potreby pridať ďalšie zlúčeniny, napríklad pridanie EDTA do tlmivého roztoku je užitočné pri premývaní červených krviniek v teste krížovej inkompatibility.

EDTA bráni štiepeniu frakcie komplementu C1 prítomnej v sére a lýzeu na červené krvinky, to znamená, že zabraňuje falošným výsledkom nekompatibility. EDTA navyše pomáha pri disociácii buniek.

príprava

Množstvo solí, ktoré sa musia odvážiť na prípravu fyziologického roztoku pufrovaného fosfátom PBS, bude závisieť od množstva, ktoré je potrebné pripraviť:

- Zásobný roztok chloridu sodného pufrovaný fosfátom (10X PBS)

Pre jeden liter roztoku:

Vážiť:

80,6 g NaCl,

2,2 g KCl,

11,5 g Na ₂ HPO ₄ ,

2,0 g KH ₂ HPO ₄

Technika prípravy

Ťažké soli vložte do kadičky, pridajte dostatočné množstvo vody (80%) a miešajte na miešacej doske s magnetickou tyčkou, kým sa soli nerozpustia.

Príprava PBS s použitím miešacej doštičky s magnetickým stĺpcom. Zdroj: Používateľ: Ruhrfisch, Wikipedia. com

Filtráciou sa odstránia nerozpustené častice. Použite filtre s pórmi 0,45 μm. Autoklávujte a asepticky sa rozdeľujte v laminárnom digestore v sklenených nádobách s viečkami.

10X roztok (koncentrovaný) neupravuje pH. Úprava sa uskutoční raz nariedená na koncentráciu 1X PBS tlmivého roztoku (riedenie 1:10).

-Ufufosfátový fyziologický roztok (1X PBS)

1X PBS sa môže pripraviť priamo, odvážiť zodpovedajúce množstvo každej soli, alebo sa môže pripraviť zriedením zásobného roztoku (1:10) sterilnou destilovanou vodou.

- Na priamu prípravu jedného litra váženého fyziologického roztoku pufrovaného fosfátom 1X PBS:

8,06 g NaCl,

0,22 g KCl,

So 1,15 g Na ₂ HPO ₄ ,

So 0,20 g KH ₂ HPO ₄

Technika prípravy

Postupujte ako je vysvetlené v koncentrovanom roztoku. Následne sa musí upraviť pH. Za týmto účelom zmerajte pH av závislosti od výsledku pomocou kyseliny (HCl) alebo bázy (NaOH) podľa potreby znižujte alebo zvyšujte pH, kým to nie je 7,4.

Kyselina alebo zásada sa pridávajú po kvapkách, pričom sa sleduje hodnota pH roztoku pomocou pH metra. Filtrujte, autoklávujte a podľa potreby asepticky rozdeľujte do kónických skúmaviek alebo pohárov.

- Na prípravu 1X PBS z 10X zásobného roztoku:

Vykonajte riedenie 1:10. Napríklad na prípravu 1 litra 1X PBS odmerajte 100 ml zásobného roztoku a pridajte 700 ml sterilnej destilovanej vody. Upravte pH a doplňte množstvo vody do 1000 ml.

Pripravený PBS pufor je bezfarebný a číry.

Denné PBS sa môže uchovávať pri izbovej teplote a zvyšok v chladničke.

Roztoky na úpravu pH

HCl

Na 100 ml 1 M HC1 (kyselina chlorovodíková).

Odmerajte 91 ml destilovanej vody a vložte ju do kadičky s objemom 250 ml.

Odmerajte 8,62 ml koncentrovanej HCl a pomaly ho pridajte do kadičky obsahujúcej vodu (nikdy to neurobte opačným spôsobom). Pri zaobchádzaní so silnými kyselinami (vysoko leptavé látky) podniknite príslušné opatrenia v oblasti biologickej bezpečnosti.

Miešajte 5 minút, najlepšie pomocou miešacej doštičky s magnetickou tyčinkou vo vnútri pohára. Prevod na banke na 100 ml a doplní sa na 100 ml destilovanej H ₂ O.

NaOH

Na 100 ml NaOH (hydroxid sodný) 10 molárnych.

Odmerajte 40 ml destilovanej vody a vložte ju do kadičky s objemom 250 ml. Odmerajte 40 g NaOH a pridajte do vody. Miešajte pomocou miešacej doštičky s magnetickou tyčinkou vo vnútri pohára.

Preneste do odmernej banky s objemom 100 ml a doplňte destilovanou vodou po značku. Dodržiavajte nariadenia o biologickej bezpečnosti, pretože táto reakcia je exotermická (uvoľňuje energiu vo forme tepla).

Ak si chcete pripraviť ďalšie množstvo fosfátového soľného roztoku, môžete si prečítať nasledujúcu tabuľku:

Zdroj: «Laboratórium vírusových a ľudských genómov, Lekárska fakulta UASLP»

aplikácia

Používa sa predovšetkým v bunkovej biológii, imunológii, imunohistochémii, bakteriológii, virológii a výskumných laboratóriách.

Je ideálny na umývanie buniek odstredením (červené krvinky), premývanie bunkových monovrstiev v spektroskopických elipsometrických technikách, na kvantifikáciu bakteriálnych biofilmov, na udržiavanie bunkových kultúr pre vírusy, ako premývací roztok v nepriamej imunofluorescenčnej technike. a v technikách na charakterizáciu monoklonálnych protilátok.

Používa sa tiež na prepravu buniek alebo tkanív, ako riedidlo na počítanie buniek, na prípravu bunkových enzýmov (trypsín), ako riedidlo na metódu vysušenia biomolekúl a na prípravu ďalších činidiel.

Na druhej strane, Martin a kol., V roku 2006 preukázali, že PBS je užitočný v forenzných vedných laboratóriách, konkrétne pri získavaní spermií z vaginálnych náterov alebo pri získavaní vaginálnych buniek z penisových náterov. Týmto spôsobom je možné zistiť, či došlo k sexuálnemu vzťahu.

obmedzenia

- Niektoré pufre PBS obsahujú látku nazývanú azid sodný ako konzervačnú látku. Táto zlúčenina môže vytvárať výbušné látky, ak príde do kontaktu s olovom alebo meďou. Z tohto dôvodu sa musí pri likvidácii tohto činidla po vypustení z odpadovej vody venovať osobitná pozornosť. Ak sa zlikviduje týmto spôsobom, musí sa pridať veľké množstvo vody, aby sa čo najviac zriedilo.

- Zinok by sa nemal pridávať do fosfátového tlmivého roztoku, pretože spôsobuje vyzrážanie niektorých solí.

- Wangen a spolupracovníci v roku 2018 stanovili, že použitie PBS nebolo vhodné na umývanie primárnych buniek akútnej myeloidnej leukémie (AML) extrahovaných z periférnej krvi, pretože mnoho buniek sa stráca lýzou, pričom došlo k veľkému poklesu materiálu proteín.

Preto určili, že primárne bunky AML by sa nemali po skladovaní v tekutom dusíku umyť PBS.

Referencie

1. Coll J. (1993). Diagnostické techniky vo virológii. Ed Díaz de Santos. 360 pg
2. Rodríguez M, Ortiz T. Bunková kultúra. Zmena média. Katedra normálnej a patologickej cytologie a histológie Univerzita v Seville. K dispozícii na stránkach personal.us.es
3. Príprava fosfátom pufrovaného fyziologického roztoku (PBS). (2008). Laboratórium štandardných pracovných postupov (SOPs) Laboratórium humánnej a vírusovej genomiky UASLP, Lekárska fakulta. K dispozícii na adrese: genomica.uaslp.mx
4. "Fosfátový tlmivý roztok." Wikipedia, slobodná encyklopédia. 3. apríla 2019, 19:36 UTC. 13. apríla 2019, 02:57 en.wikipedia.org.
5. Pietrasanta L, Von-Bilderling C. Témy v molekulárnej biofyzike. K dispozícii na adrese: users.df.uba.ar
6. Rediar. Manuálny. PBS + EDTA. K dispozícii na adrese: felsan.com.ar
7. Martin NC, Pirie AA, Ford LV, Callaghan CL, McTurk K, Lucy D, Scrimger DG. Použitie fosfátom pufrovaného soľného roztoku na regeneráciu buniek a spermií z tampónov. Sci Justice. 2006; 46 (3): 179-84. K dispozícii na adrese: ncbi.nlm.nih.gov
8. Wangen R, Aasebø E, Trentani A, a kol. Metóda konzervácie a premývanie fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom ovplyvňuje proteín akútnej myeloidnej leukémie. Int J Mol Sci. 2018; 19 (1): 296. K dispozícii na adrese: ncbi.nlm.nih.gov
9. Martínez R., Gragera R. (2008). Teoretické a praktické základy histochémie. Najvyššia rada pre vedecké vyšetrovania. Madrid. K dispozícii na adrese: books.google.co.ve