BIURET: ZDÔVODNENIE, ČINIDLÁ, POSTUP, POUŽITIA - BIOLÓGIE - 2025

Biuretu je činidlo používa na stanovenie proteínov s dlhým reťazcom a s krátkym reťazcom. Používa sa najmä v oblasti analytickej chémie a analýzy moču na zisťovanie koncentrácie celkových proteínov v sére, plazme a moči.

Hodnoty proteínov sa môžu pri určitých patológiách zvýšiť alebo znížiť. Symptómy hypoproteinémie sa zvyčajne vyskytujú u pacientov s ochorením obličiek, u podvýživených pacientov au pacientov s chronickými infekciami.

Chemická štruktúra komplexu vytvoreného pri Biuretovej reakcii Pozitívny Biuretov test. Zdroj: Yikrazuul / flickr

Zatiaľ čo hyperproteinémia sa pozoruje okrem iného v patológiách, ako sú napríklad mnohopočetný myelóm, systémový lupus erythematodes, bakteriálna endokarditída, bakteriálna meningitída, Waldenstromova makroglobulinémia.

Na druhej strane prítomnosť bielkovín v moči je spôsobená filtráciou albumínu obličkami. Toto je patologické správanie, ktoré sa musí študovať.

V tomto zmysle je Biuret veľmi užitočný, pretože umožňuje kvantifikovať prítomnosť proteínov v sére, plazme, moči a mnohých ďalších vzorkách.

Dokonca aj Biuret sa môže použiť na skúmanie prítomnosti a koncentrácie proteínov v zle preskúmaných vzorkách alebo vzorkách s neznámym zložením. Preto je široko používaný v oblasti výskumu.

Biuretov test je založený na detekcii peptidových väzieb. Test sa vykonáva v alkalickom prostredí. Aby sa vytvoril komplex fialovo-fialová, vzorka musí obsahovať najmenej dve peptidové väzby. Komplex je tvorený spojením väzieb a iónov medi.

základ

Činidlo Biuretu sa skladá z hydroxidu draselného, ​​síranu meďnatého a vínanu sodného a draselného. Hydroxid sodný sa používa na alkalizáciu média, pretože táto podmienka je nevyhnutná pre uskutočnenie reakcie.

Látky, ktoré reagujú s proteínmi, sú síran meďnatý, zatiaľ čo vínan sodný má funkciu, ktorá neumožňuje tvorbu hydroxidu meďnatého, ktorý má tendenciu zrážať sa a interferovať s reakciou.

Ak sa vo vzorke nájdu látky s peptidovými väzbami (polypeptidy alebo proteíny), test bude pozitívny.

Reakcia sa interpretuje ako pozitívna, keď roztok zmení farbu na fialovú. Farba je vytvorená vytvorením komplexu medzi najmenej dvoma peptidovými väzbami, ktoré majú skupinu CO-NH a meďné katióny.

Fialový komplex sa môže tvoriť dvoma spôsobmi: jedným je strata protónov z amidových skupín, ktoré sa viažu na kov (depronotácia), a druhým spojením kyslíkových a dusíkových elektrónov, ktoré sú voľné a viažu sa s meďou.

Táto reakcia sa môže líšiť v intenzite a farbe v závislosti od typu proteínu.

Test sa môže vykonať kvalitatívne alebo kvantitatívne. V kvalitatívnej podobe sa uvádza ako pozitívny alebo negatívny. Zatiaľ čo v kvantitatívnej forme sa koncentrácia môže merať spektrofotometrickou metódou.

Reakcia sa odčíta medzi 540 - 560 nm. Intenzita farby je priamo úmerná koncentrácii peptidových väzieb vo vzorke.

reagents

-20% hydroxid sodný (NaOH)

-Cupric pentahydrátu síranu 1% (CuSO ₄ 5H ₂ O)

-Zmesi sodného a vínan draselný tetrahydrát (KNAC ₄ H ₄ O ₆ · 4H ₂ O)

Stabilita činidla biuretu

- Musí sa uchovávať v chlade.

proces

technika

- Vložte 100 µl vzorky alebo štandardu, ktorý sa má analyzovať, do skúmavky.

- Pridajte 2 ml hydroxidu sodného.

-Miešajte veľmi dobre.

- Pridajte 5 ml Biuretovho činidla.

- Zmiešajte a nechajte stáť 25 minút pri izbovej teplote, zakryte a chráňte pred svetlom.

-Zabezpečte tvorbu alebo nezafarbenie a zmerajte spektrofotometricky.

Kalibračná krivka

Hovädzí sérový albumín sa môže použiť ako štandard na vykonanie kalibračnej krivky. Z toho sa pripravujú rôzne koncentrácie. Napríklad 25, 50, 75, 100, 125 a 150%.

Reakcia sa nastaví na všetky tieto známe koncentrácie a absorbancia sa odčíta pri vlnovej dĺžke 540 nm. Na základe údajov o známych koncentráciách a absorbancii sa urobí kalibračná krivka.

Pri každom stanovení alebo sérii spracovaných vzoriek sa odporúča pripojiť štandard. Ako kalibračný štandard sa môže použiť hovädzí sérový albumín 0,1 - 2 mg / ml.

Merania sa uskutočňujú na spektrofotometri pri 540 nm.

Linearita sa dosiahne až do koncentrácie 12 g / dl.

zasahovanie

Látky, ktoré interferujú s testom Biuret

Aj keď to nie je veľmi časté, treba poznamenať, že niektoré látky môžu počas vykonávania tohto testu interferovať. Napríklad prítomnosť amoniaku môže inhibovať tvorbu zafarbenia.

Podobne aj iné látky mohli absorbovať pri rovnakej vlnovej dĺžke, napríklad určité pigmenty.

Na druhej strane môže dôjsť k interferencii, keď látka, ktorá nie je peptidovou väzbou, tvorí komplex so soľou meďnou. Príklad: niektoré uhľohydráty a určité lipidy.

V prípade, že vzorka, ktorá sa má analyzovať, obsahuje nejaký druh zrazeniny, musí sa pred namontovaním testu prefiltrovať alebo odstrediť.

Látky, ktoré nezasahujú do testu Biuret

Test nie je ovplyvnený prítomnosťou:

-Bilirubín až do koncentrácie 20 mg / dl.

-Hemoglobín až do koncentrácie 750 mg / dl.

- dextrán až do koncentrácie 30 g / l.

- triglyceridy až do koncentrácie 4 000 mg / dl.

výhoda

-Je to jednoduchá metóda na vykonanie.

-Je to ekonomický test.

- Má vysokú špecificitu pre proteíny.

- Malé rušenie.

nevýhody

Má nízku citlivosť na detekciu nízkych množstiev bielkovín. Práca, ktorú vykonali Fuentes et al., Potvrdzuje, že testovacia metóda Biuret má detekčný limit 1 mg / ml proteínu a limit kvantifikácie 3 mg / ml.

Iné výskumy uskutočňované na amazonskej univerzite však uvádzajú oveľa nižšie hodnoty. Detekčný limit uvádzaný v štúdii je 0,020 mg / ml a kvantifikačný limit je 1,33 mg / ml.

aplikácia

Činidlo alebo test Biuret sa používa na stanovenie bielkovín v klinických a neklinických vzorkách v bežných a výskumných laboratóriách.

Patológie, ktoré sa vyskytujú so zvýšením alebo znížením

V mnohých patológiách je dôležité určiť koncentráciu celkových proteínov v klinických vzorkách, ktorá môže byť zvýšená alebo znížená.

Sú vyzdvihnuté v:

- Viacnásobný myelóm,

-Systémový lupus erythematodes,

- bakteriálna endokarditída,

- bakteriálna meningitída,

Waldenstromova makroglobulinémia.

Znižuje sa:

-Obecná nedostatočnosť,

- Ľudia so silnou podvýživou,

- Pacienti s chronickými infekciami, okrem iného.

Klinické vzorky

Najbežnejšie klinické vzorky sú sérum, plazma a moč. Normálna hodnota proteínov v sére alebo plazme je 6,0 - 8,8 g / dl.

Koncentrácia bielkovín v moči u dospelých nepresahuje 150 mg / 24 hodín.

Pomer bielkovín v moči a kreatinínu v moči je normálny

Dojčatá: <0,50 mg

Deti od 2 rokov: index: 0,20 mg

Dospelí: <0,2 mg

Predklinické vzorky

Reakciu Biuret je možné použiť pre mnoho typov neklinických vzoriek, ako sú mliečne výrobky, antivenom alebo akákoľvek neznáma látka, pre ktorú chcete vyšetriť prítomnosť proteínov.

Referencie

1. Vázquez J, Guerra L, Quintana J, Ramírez J, Fernando Ry Vázquez Y. (2014). Fyzikálno-chemická charakterizácia a obsah bielkovín v tekutých extraktoch z mangrovovej ustrice (Crassostrearizophorae). Cuban Journal of Chemistry, 26 (1), 66-74. Získané 26. júna 2019 z http: //scielo.sld
2. Chaparro S, Lara A, Sandoval A, Sosa S, Martínez J., Gil J. Funkčná charakterizácia mandlí mangových semien (Mangifera indica L.) Revista Ciencia en Desarrollo. 2015; 6 (1): 67 - 75
3. "Biuret". Wikipedia, slobodná encyklopédia. 19. júna 2019, 16:37 UTC. 26. júna 2019, 22:18
4. Fuentes F, Quispe I, García J. Štandardizácia Biuretovej metódy na kvantifikáciu celkových proteínov v polyvalentnom antibotropnom sére vyrobenom v Národnom centre pre biologické produkty INS. Bol - Inst Nac Salud 2012; 18 (11-12). K dispozícii na adrese: repositorio.ins.gob.pe
5. Výherné laboratóriá. Celkové bielkoviny. Kolorimetrická metóda na stanovenie celkových proteínov v sére a plazme. K dispozícii na: wiener-lab.com.ar