LÖWENSTEIN-JENSEN MÉDIUM: ZALOŽENIE, PRÍPRAVA A POUŽITIE - BIOLÓGIE - 2025

Lowenstein-Jensen médium je selektívne pevné médium pre izoláciu a vývoj baktérií rodu Mycobacterium, ako je Mycobacterium tuberculosis, M. avium, okrem iného, s výnimkou druhu leprae, ktorá nie je kultivovatelných.

Baktérie rodu Mycobacterium nerastú v konvenčných kultivačných médiách, preto bolo potrebné navrhnúť špeciálne médium na ich izoláciu. Pôvodné médium vytvoril Löwenstein a neskôr ho upravil Jensen.

Löwenstein-Jensenovo médium s kolóniami Mycobacterium tuberculosis. Zdroj: Agarwal a kol., BioMed Central Ltd., so súhlasom Biology Image Library

Úprava spočívala v odstránení konžského červeného farbiva a jeho nahradení vyššou koncentráciou malachitovej zelene. Tiež zmenil koncentrácie citranu horečnatého a fosforečnanu draselného.

Médium Löwenstein-Jensen v súčasnosti obsahuje zemiakový škrob, asparagín, citrát horečnatý, fosforečnan draselný, síran horečnatý, malachitovú zeleň, kyselinu nalidixovú, cykloheximid, lincomycín, rozbité vajcia, glycerín a vodu.

Mykobaktérie sa normálne izolujú z miest, ktoré nie sú sterilné, ako je napríklad sputum, moč, abscesy. To znamená, že väčšina vzoriek bude obsahovať zvyčajnú mikrobiotiku oblasti a patogén.

Preto médium Löwenstein-Jensen obsahuje vo svojom zložení rad inhibítorov predstavovaných malachitovou zeleňou, antibiotikami a fungicídmi.

Okrem toho musia byť vzorky, ktoré pochádzajú z nesterilných miest, dekontaminované a neutralizované pred vysiatím do média Löwenstein-Jensen.

základ

Prítomnosť vajec a glycerínu v médiu Löwenstein-Jensen stimuluje rast mykobaktérií, pretože poskytujú mastné kyseliny a bielkoviny potrebné na rozvoj týchto mikroorganizmov.

Médium Löwenstein-Jensen obsahuje malachitovú zeleň, ktorá je inhibítorom sprievodnej mikrobioty. Obsahuje však aj kyselinu nalidixovú (35 µg / ml), ktorá inhibuje gramnegatívnu mikrobiotiku, cykloheximid (400 ug / ml), ktorý inhibuje saprofytické huby a kvasinky, a lincomycín (2 μ / ml), ktorý inhibuje grampozitívnu mikrobiotu.

Niektoré obchodné domy radšej pridávajú nasledujúcu kombináciu antibiotík: polymyxín B 200 000 jednotiek / l, amfotericín B 10 mg / l, karbenicilín 50 mg / l a trimetoprim 10 mg / L.

Toto médium neobsahuje agar, preto k tuhnutiu média dochádza v dôsledku koagulácie albumínu prítomného vo vajci počas sterilizácie.

príprava

Navážte 37,3 g dehydratovaného média v 600 ml destilovanej vody, do ktorej bolo predtým pridaných 12 ml glycerolu. Zmes sa zahrieva za častého miešania až do úplného rozpustenia. Médium sa autoklávuje pri 121 ° C počas 15 minút.

Na druhej strane by sa za aseptických podmienok mala pripraviť homogénna suspenzia 1 000 ml čerstvých vajec. Pridajte vaječnú suspenziu k 600 ml média pripraveného pri teplote 50 - 60 ° C tak, aby sa zabránilo vzduchovým bublinám.

Antibiotické roztoky sa tiež pridávajú po sterilizácii v autokláve.

Nalejte médium do sterilných skúmaviek s uzáverom. Skúmavky zahrievajte pri teplote 85 ° C počas 45 minút v naklonenej polohe.

Farba pripraveného média je akvamarínová zelená a kvôli prítomnosti vaječných lipidov môže vykazovať belavé škvrny.

PH média musí byť 7,2 ± 0,2

Skúmavky skladujte až do použitia v chladničke a chránené pred priamym svetlom. Pred výsevom temperujte.

Existuje modifikácia média s názvom „Gruftova modifikácia Löwenstein Jensen“. Táto obsahuje rovnaké zlúčeniny ako klasické médium, ale pridá sa RNA-5 mg / 100 ml a ako inhibítory obsahuje zelenú malachitovú 0,025 g / 100 ml, penicilín 50 U / ml a kyselinu nalidixovú 35 ug / ml.

aplikácia

Médium Löwenstein-Jensen sa používa na izoláciu mykobaktérií z rôznych typov vzoriek. Ziehl-Neelsenovo farbenie sa odporúča pre všetky vzorky, u ktorých existuje podozrenie na prítomnosť mykobaktérií.

Niektoré vzorky pochádzajú zo sterilných miest, iné nie. Nesterilné vzorky sa musia podľa potreby dekontaminovať:

chrchel

Vzorky spúta by sa mali dekontaminovať nasledujúcim spôsobom: určiť množstvo vzorky spúta v ml a do vzorky pridať rovnaké množstvo 4% NaOH a inkubovať pri 37 ° C.

Zmes sa často pretrepáva do 30 minút. Následne sa odstreďuje pri 3000 otáčkach za minútu počas 30 minút.

Supernatant zlikvidujte cez fenolický dezinfekčný roztok. Na výsev použite sediment, ale najprv musí byť pH neutralizované.

Pre neutralizáciu sediment, 5% H ₂ SO ₄ sa používa v prítomnosti červeného indikátora fenolové, kým sa nedosiahne neutrálneho pH, ktoré vytvára lososovú farbu.

Výplach žalúdka, výplach priedušiek a priedušok priedušiek

V tomto prípade sa vzorka musí odstrediť pri 3000 otáčkach za minútu počas 30 minút. Supernatant sa odstráni a použije sa peleta. Na dekontamináciu sedimentu pridajte 3 ml 4% NaOH a často miešajte pri 37 ° C po dobu pol hodiny.

Znovu odstreďte, supernatant sa odstráni a použije sa peleta. Táto musí byť neutralizovaná, ako je vysvetlené vo vzorke spúta.

moč

Nechajte vzorku usadiť sa v chladničke 24 hodín. Oddeľte supernatant. Zostávajúca peleta by sa mala odstreďovať 30 minút pri 3000 RMP. Supernatant sa znova zlikviduje a peleta sa rekonštituuje 3 ml sterilného fyziologického roztoku.

Pridajte 3 ml 4% NaOH a pokračujte v dekontaminácii a neutralizácii, ako je opísané vyššie.

Ascitická tekutina, pleurálna tekutina, cerebrospinálna tekutina

V tomto type vzorky sa odstredí a supernatant sa zlikviduje. Vykonajte Gram na sedimente alebo pozorujte priamo pod mikroskopom; Ak baktérie nie sú pozorované, krok dekontaminácie nie je potrebný, ani krok neutralizácie.

V tomto prípade sa vzorka môže naočkovať priamo pomocou sedimentu. Ak existujú baktérie, pokračujte v dekontaminácii a neutralizujte, ako je opísané vyššie.

biopsia

K tomuto typu vzorky sa musí pridať 5 ml destilovanej vody na neskoršiu centrifugáciu pri 1500 ot / min počas 10 minút. Supernatant sa zlikviduje a peleta sa znovu odstreďuje pri 3500 ot./min. Počas 30 minút. Použite sediment na siatie kultivačného média.

Tampón hltanu

Tampón by sa mal umiestniť do sterilnej skúmavky obsahujúcej rovnaké diely destilovanú vodu a 4% NaOH. Tampón musí byť pritlačený na steny skúmavky tak, aby bola vzorka zriedená v kvapaline. Odstreďte a použite sediment. Sediment neutralizujte, ako už bolo uvedené.

osiatych

Médium Löwenstein-Jensen sa naočkuje pridaním 0,5 ml vzorky na povrch média. Skúmavku otáčajte, aby sa vzorka rozdelila do média. Nepoužívajte platinovú rukoväť.

Druhá skúmavka obsahujúca médium Stonebrink sa môže naočkovať, aby sa izoloval Mycobacterium bovis a ďalšie druhy, ktoré nerastú na médiu Löwenstein-Jensen.

inkubácie

Inokulované skúmavky sa inkubujú aeróbne pri 37 ° C, s vekom mierne uvoľneným a nakloneným pri približne 5 ° a chráneným pred svetlom. Prostredie môže byť obohatené o 5 - 10% oxidu uhličitého. Kultúry kontrolujte dvakrát týždenne, až kým sa neobjavia kolónie.

Po absorpcii vzorky sa uzávery utiahnu. Maximálna doba inkubácie je 8 týždňov, ak po uplynutí tejto doby nedochádza k rastu, je zaznamenaná ako negatívna.

QA

Ako kontrola kvality sa môžu použiť tieto kmene:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Cryptococcus of Cccccccus, Cccfcccccus, Cccccccccccus, Cccccccc, Ccccccccc, Cccccccccccc, Cccccc,

Vynikajúci vývoj sa očakáva pri prvých troch uvedených druhoch, pre M. fortuitum by mal byť rast dobrý, zatiaľ čo pre M. bovis sa očakáva nízky alebo žiadny rast. Medzitým sa musia úplne inhibovať druhy iné ako rod Mycobacterium.

obmedzenia

Pripravené médium musí byť chránené pred svetlom, dlhodobé vystavenie svetlu spôsobuje, že sa médium zmení zo zelenej na modrú, v tomto prípade sa už médium nemôže používať. Dôvodom je skutočnosť, že malachitová zelená je fotocitlivá.

Médium, pretože obsahuje vajcia, môže byť ľahko kontaminované, ak sa s ním nezaobchádza asepticky. Môže byť rozpustený, ak je kontaminovaný proteolytickými baktériami.

Pestovanie a manipulácia s baktériami rodu Mycobacterium si vyžaduje kvalifikovaný personál, ktorý je oboznámený s opatreniami biologickej bezpečnosti, ktoré sa musia dodržiavať, aby sa zabránilo kontaminácii alebo kontaminácii iných.

HCl by sa nemala používať v neutralizačnom kroku z dôvodu tvorby chloridu sodného, ​​ktorý môže byť toxický pre Kochov bacil.

Vzorky by sa mali uchovávať v chlade a chrániť pred svetlom, kým sa nespracúvajú.

referencie

1. Francisco Soria Melguizo Laboratories. 2009. Selektívne médium Löwenstein-Jensen. K dispozícii na adrese: f-soria.es
2. Britannia Laboratories. 2017. Löwenstein-Jensen medium. K dispozícii na adrese: britanialab.com.
3. Neogen Laboratories. Löwenstein-Jensen médium. K dispozícii na adrese: foodsafety.neogen.com.
4. "Löwenstein-Jensen medium." Wikipedia, slobodná encyklopédia. 20. novembra 2018, 15:15 UTC. 24. apríla 2019, 18:34. wikipedia.org
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vydanie. Editorial Panamericana SA Argentína.
6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentína.
7. Mac Faddin J. (2003). Biochemické testy na identifikáciu baktérií klinického významu. 3. vydanie. Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentína.