BAKTERIÁLNY NÁTER: VLASTNOSTI A PRÍPRAVA - BIOLÓGIE - 2025

Bakteriálna škvrna je tenký film škvrna suspenzie bakteriálnych mikroorganizmov, ktoré je vyrobené z priehľadnej sklenenej dosky alebo sklíčko, na pozorovanie pod svetelným mikroskopom.

Predĺženie vo forme filmu sa uskutočňuje s cieľom čo najviac oddeliť mikroorganizmy, pretože ak sú zoskupené, pozorovanie nie je jasné.

Obrázok 1. Bakteriálny náter pozorovaný pod skenovacím elektrónovým mikroskopom. Zdroj: pixbay.com

Pri štúdiu bakteriálnych kultúr sa na ich lepšiu analýzu používajú techniky prípravy stôp, fixácie a farbenia. Kvôli malej veľkosti mikroorganizmov je na ich pozorovanie nevyhnutne potrebné použitie optického mikroskopu.

Optické mikroskopy sú nevyhnutnými nástrojmi na pozorovanie náterov. Používajú optické šošovky a svetlo, ktoré umožňuje prezeranie vzoriek s veľkým zväčšením.

Živé bunky vo všeobecnosti nemajú väčšinou farebné štruktúry, videné svetelným mikroskopom, sú to bezfarebné, priehľadné vzorky a vykazujú veľmi malý vnútorný kontrast a prostredie.

Pozorovanie pomocou svetelného mikroskopu s ľahkým poľom bez použitia pomocných farbiacich techník je veľmi obmedzené a používa sa iba v niektorých prípadoch, napríklad pri pozorovaní pohybu mikroorganizmov.

Na optimálne pozorovanie mikroorganizmov je potrebné nájsť rovnováhu medzi kontrastom a rozlíšením. Detaily buniek nie je možné vidieť pod mikroskopom, a to ani pri vysokom rozlíšení; Použitie farbív sa vyžaduje technikami farbenia, ktoré poskytujú kontrast na pozorovanie.

Vlastnosti bakteriálneho náteru dobrej kvality

Vynikajúci kontrast

Na dosiahnutie vynikajúceho kontrastu existujú sofistikované mikroskopy nazývané mikroskopy s fázovým kontrastom, mikroskopy s diferenčnou interferenciou a mikroskopy v tmavom poli. Tento typ mikroskopu sa okrem iného používa na pozorovanie bakteriálnych štruktúr, ako sú puzdrá a vlákna.

Farbenie je jednoduchá technika na zvýšenie kontrastu, ktorá sa dosahuje mikroskopom s jasným poľom. Pri tejto technike sa môžu použiť rôzne škvrny, ktoré významne zlepšujú mikroskopické pozorovanie.

Škvrny sa uskutočňujú priamo na náteroch alebo na predlženiach suspenzií mikroorganizmov na podložných sklíčkach, vopred vysušených a fixovaných.

Dobrá oprava

Fixácia je technika používaná na zachovanie bunkových štruktúr; spôsobuje inaktiváciu mikroorganizmov a priľnavosť k sklu sklíčka. Existujú rôzne spôsoby fixácie: tepelná fixácia a chemická fixácia.

Tepelná fixácia

Toto je najčastejšie používaná metóda na pozorovanie bakteriálnych náterov. Táto technika spočíva v prechode bakteriálnej suspenzie náteru plameňom zapaľovača. Táto technika je schopná zachovať vonkajšiu morfológiu baktérií, ale ničí ich vnútorné štruktúry.

Chemická fixácia

Chemická fixácia používa okrem iného konzervačné chemikálie, ako je formaldehyd alebo formalín, etanol a kyselina octová. Výhodou použitia chemických fixačných činidiel je dosiahnutie ochrany vnútorných bunkových štruktúr mikroorganizmov.

Obrázok 2. Krvný náter. Zdroj: Bobjgalindo, z Wikimedia Commons

Dobré zafarbenie

Najbežnejšie postupy na farbenie predtým vysušeného a fixovaného náteru sú pozitívne alebo jednoduché zafarbenie, diferenciálne zafarbenie a negatívne zafarbenie. Existujú tiež špeciálne techniky na farbenie konkrétnych bunkových štruktúr (kapsuly, spór, bičíkov).

Pozitívne farbenie alebo jednoduché farbenie

Pozitívne alebo jednoduché zafarbenie je najčastejšie používanou technikou zafarbenia. Používa farbivá, ktoré majú schopnosť viazať sa na určité mikrobiálne štruktúry, čo umožňuje ich pozorovanie pod mikroskopom.

Tieto farbivá majú vo svojej chemickej štruktúre chromoforové skupiny (farebnú časť) so striedajúcimi sa dvojitými väzbami a jednoduchými väzbami (konjugácia). Tieto väzby môžu zase vytvárať iónové alebo kovalentné väzby s niektorými bunkovými štruktúrami.

Farbivá použité pri pozitívnom alebo jednoduchom farbení sú väčšinou chemické deriváty anilínu (farbené organické soli).

Na druhej strane, medzi farbivami nájdeme niektoré s bázickým pH a iné s kyslým pH.

Základné farbivá

V základných farbivách má chromoforová skupina kladný elektrický náboj. Drvivá väčšina prokaryotických mikroorganizmov má neutrálne vnútorné pH a ich bunkový povrch je záporne nabitý. Prostredníctvom tejto elektrostatickej interakcie sa chromofor viaže na bunku a zafarbí ju.

Príkladmi základných farbív sú okrem iného metylénová modrá, kryštalická fialová, malachitová zelená, bázický fuscín, safranín.

Kyslé farbivá

V kyslých farbivách má chromoforová skupina záporný elektrický náboj. Tieto sa používajú na farbenie proteínov pozitívne nabitými aminoskupinami. Príkladmi kyslých farbív sú kyslý fuscín, ružová bengálsko, konžská červeň a eozín.

Diferenciálne sfarbenie

Technika diferenciálneho farbenia spočíva v použití dvoch farbív rôznej farby alebo intenzity na rozlíšenie rôznych mikroorganizmov pod mikroskopom. Gramovo farbenie a farbenie odolné voči kyselinám a alkoholom sú najčastejšie používanými diferenciálnymi škvrnami v bakteriológii.

Gramovo farbenie sa používa ako predbežný test na poznanie tvaru, veľkosti, zoskupenia buniek, ako aj typu bunkovej steny. Použitím testu Gramovho farbenia sa baktérie bunkovej steny klasifikujú na gramnegatívne baktérie a gramnegatívne baktérie.

Negatívne zafarbenie

Pri tejto technike sa používajú chemické farbivá, ktoré neprenikajú dovnútra bunky, ale vytvárajú médium, v ktorom sa mikroorganizmy objavujú, ako čierne pozadie.

Pri technike negatívneho farbenia je náter vyrobený z kvapky indickej farby alebo suspenzie nigrosínu, ktorá po umožnení sušenia pri izbovej teplote vytvára nepriehľadný film na priechod svetla. Týmto spôsobom sa mikroorganizmy javia ako svetlé tvary na tmavom pozadí.

príprava

A. Rozter

1. - Sklíčka dôkladne umyte, osušte savým papierom a označte. Na etikete musí byť uvedený obsah prípravku, dátum a meno osoby, ktorá ho spracovala.

2.- Zapaľovač zapaľujte a očkovaciu slučku v plameni sterilizujte, až kým nebude jasne červená.

3.- Rukoväť nechajte vychladnúť.

4. - Zoberte skúmavku na bakteriálnu kultiváciu, odstráňte uzáver a rýchlo preneste ústa skúmavky blízko plameňa horáka (plameň).

5. Vložte očkovaciu slučku do skúmavky obsahujúcej bakteriálnu kultúru a odoberte vzorku.

6. - Ak je kultúra v tekutom médiu, umiestnite vzorku odobratú s rukoväťou do stredu podložného sklíčka a opatrne ju rozložte do kruhu s priemerom približne 2 cm.

7. - Inokulačnú slučku znova sterilizujte.

8.- Nechajte náter zaschnúť na vzduchu.

9.- Opakujte kroky 3 až 8 trikrát.

10.- Ak je kultúra v pevnom médiu, musí sa na podložné sklíčko vopred umiestniť kvapka destilovanej vody. Toto sa uskutoční zmiešaním malej vzorky kultúry odobranej s očkovacou slučkou podľa pokynov v krokoch 2 až 5 (aseptické podmienky).

11. - Nariedenú vzorku rozotrite kvapkou vody na podložné sklíčko a opakujte trikrát.

B. Fixácia

1.- Do suchých náterov - z kultúr v tekutom médiu - pridajte dve kvapky metanolu alebo absolútneho etanolu.

2.- Umožnite vysušeniu vzduchu mimo zapaľovača.

3. - Ak náter pochádza z kultúry v pevnom médiu, suchý náter sa zafixuje teplom, ktorý ho rýchlo prechádza 2 až 3 krát najteplejším dielom ľahšieho plameňa.

4.- Dotknite sa spodnej časti náteru chrbtovou časťou ľavej ruky (pre pravákov, inak použite pravú ruku) a overte, či je studená.

C. Jednoduché farbenie

1.- Pridajte do náteru 2 kvapky zvolenej škvrny a nechajte pôsobiť tak, ako je to potrebné v protokoloch špecifických pre každú škvrnu (zvyčajne medzi 1 a 5 minútami).

2.- Niektoré škvrny vyžadujú pre svoju aktiváciu použitie tepla, v takom prípade je potrebné postupovať veľmi opatrne pri zahrievaní šmýkača v ľahšom ohni (manipulujte s pinzetou a vyvarujte sa varu). Prehrievanie náteru môže zničiť bunky, ktoré sa majú pozorovať.

3.- Prebytočné farbivo odstráňte premytím destilovanou vodou z pikniku. Odstráňte vodu z prania jemným poklepaním na posúvač na jej okraji, nakloneným na pracovnom stole.

4.- Umožnite sušenie na vzduchu.

5. - V závislosti od typu pozorovania sa v tejto fáze používa alebo nepoužíva krycie sklíčko. Krycie sklíčko chráni a zachováva náter. Ak sa v tejto fáze vykoná pozorovanie olejovej imerzie, nepoužijú sa žiadne krycie sklíčka, ale náter sa nedá zachovať.

D. Konečné zachovanie náteru

1. - Náter postupne ponorte do každého z riešení uvedených nižšie, minimálne na 5 minút. Účelom týchto „kúpeľov“ je úplná dehydratácia náteru. Pred zavedením náteru do nasledujúceho kúpeľa by sa malo každé činidlo dôkladne vypustiť.

Poradie dehydratačných kúpeľov je nasledovné:

1. Etanol 70%
2. 95% etanol
3. Čistý acetón
4. Zmes acetón -xylol 1: 1
5. xylol

Potom nechajte uschnúť na vzduchu.

2. - Kryciu sklíčko namontujte, pokiaľ možno 22 × 22 mm, pomocou balzamu z Kanady alebo iného upevňovacieho média.

Referencie

1. Briggs, G. (1965). Príčinné faktory v mikrobiologických laboratórnych nehodách a infekciách. Biologické laboratóriá USA. Fort Detrick.
2. Cappucino, JG a Welch, CT (2017). Mikrobiológia: Laboratórna príručka. Pearson.
3. Holt, editor JG. (1977). Kratšia Bergeyova príručka determinačnej bakteriológie. 8 ^th Baltimore: Williams a Wilkins Co.
4. Johnson, TR a Case; CL (2018). Laboratórne experimenty v mikrobiológii. Pearson.
5. Tille, P. (2017). Diagnostická mikrobiológia. 14 ^th St. Louis, USA: Elsiever, Inc.