ENDONUKLEÁZY: FUNKCIE, TYPY A PRÍKLADY - BIOLÓGIE - 2025

Tieto endonukleázy sú enzýmy, ktoré prechádza fosfodiesterové väzby umiestnené v nukleotidovej reťazca. Endonukleázové reštrikčné miesta sú veľmi rozmanité. Niektoré z týchto enzýmov štiepia DNA (kyselina deoxyribonukleová, náš genetický materiál) takmer kdekoľvek, to znamená, že nie sú špecifické.

Na rozdiel od toho existuje ďalšia skupina endonukleáz, ktoré sú veľmi špecifické v oblasti alebo sekvencii, ktorá sa má štiepiť. Táto skupina enzýmov je známa ako reštrikčné enzýmy a sú veľmi užitočné v molekulárnej biológii. V tejto skupine máme známe enzýmy Bam HI, Eco RI a Alu I.

Endonukleázy interne štiepia DNA.
Zdroj: pixabay.com

Na rozdiel od endonukleáz existujú aj iné typy katalytických proteínov - exonukleázy -, ktoré sú zodpovedné za prerušenie fosfodiesterových väzieb na konci reťazca.

Reštrikčné endonukleázy

Reštrikčné endonukleázy alebo reštrikčné enzýmy sú katalytické proteíny, ktoré sú zodpovedné za štiepenie fosfodiesterových väzieb vo vnútri reťazca DNA vo veľmi špecifických sekvenciách.

Tieto enzýmy je možné zakúpiť od viacerých biotechnologických spoločností a ich použitie je v súčasných technikách manipulácie s DNA takmer nevyhnutné.

Reštrikčné endonukleázy sa pomenúvajú podľa prvých písmen binomického vedeckého názvu organizmu, z ktorého pochádzajú, za ktorým nasleduje kmeň (toto je voliteľné) a končí skupinou reštrikčných enzýmov, ku ktorým patria. Napríklad BamHI a EcoRI sú široko používané endonukleázy.

Oblasť DNA, ktorú enzým rozoznáva, sa nazýva reštrikčné miesto a je jedinečná pre každú endonukleázu, aj keď sa na reštrikčných miestach môže zhodovať niekoľko enzýmov. Toto miesto sa všeobecne skladá z krátkej palindromickej sekvencie s dĺžkou približne 4 až 6 párov báz, ako je AGCT (pre Alu I) a GAATTC pre EcoRI.

Palindromické sekvencie sú sekvencie, ktoré hoci sú čítané v smere 5 'až 3' alebo 3 'až 5', sú identické. Napríklad v prípade EcoRI je palindromická sekvencia: GAATTC a CTTAAG.

Funkcie a aplikácie reštrikčných endonukleov

Našťastie pre molekulárnych biológov si baktérie v priebehu vývoja vyvinuli sériu reštrikčných endonukleáz, ktoré vnútorne fragmentujú genetický materiál.

Tieto enzýmy sa v prírode vyvinuli - pravdepodobne - ako bakteriálny ochranný systém proti invázii cudzích molekúl DNA, ako sú napríklad tie z fágov.

Za účelom rozlíšenia medzi natívnym a cudzím genetickým materiálom môžu tieto reštrikčné endonukleázy rozpoznávať špecifické nukleotidové sekvencie. DNA, ktorá nemá túto sekvenciu, sa teda môže vo vnútri baktérií ničím nerušiť.

Naopak, keď endonukleáza rozpoznáva reštrikčné miesto, viaže sa na DNA a štiepi ju.

Biológovia sa zaujímajú o štúdium genetického materiálu živých vecí. DNA sa však skladá z niekoľkých miliónov párov báz. Tieto molekuly sú extrémne dlhé a musia sa analyzovať v malých fragmentoch.

Na dosiahnutie tohto cieľa sú reštrikčné endonukleázy integrované do rôznych protokolov molekulárnej biológie. Napríklad individuálny gén sa môže zachytiť a replikovať pre ďalšiu analýzu. Tento proces sa nazýva „klonovanie“ génu.

Polymorfizmus dĺžky reštrikčných fragmentov (RFLP)

Polymorfizmy dĺžky reštrikčných fragmentov sa týkajú štruktúry špecifických nukleotidových sekvencií v DNA, ktoré sú schopné rozoznávať a štiepiť reštrikčné endonukleázy.

Vďaka špecifickosti enzýmov je každý organizmus charakterizovaný špecifickým vzorom rezania v DNA, ktorý pochádza z fragmentov s rôznou dĺžkou.

Druhy reštrikčných endonukleáz

Historicky boli reštrikčné endonukleázy klasifikované do troch typov enzýmov označených rímskymi číslicami. Nedávno bol opísaný štvrtý typ endonukleázy.

Typ I

Najdôležitejšou charakteristikou endonukleáz typu I je to, že sú to proteíny tvorené z niekoľkých podjednotiek. Každá z týchto funkcií funguje ako jediný proteínový komplex a obvykle má dve podjednotky nazývané R, dve M a jedna S.

Časť S je zodpovedná za rozpoznanie reštrikčného miesta v DNA. R podjednotka je nevyhnutná na štiepenie a M je zodpovedný za katalyzovanie metylačnej reakcie.

Bežne sa používajú štyri podkategórie enzýmov typu I, známe pod písmenami A, B, C a D. Táto klasifikácia je založená na genetickej komplementácii.

Enzýmy typu I boli prvé reštrikčné endonukleázy, ktoré boli objavené a purifikované. Najužitočnejšie v molekulárnej biológii sú však typy II, ktoré budú opísané v nasledujúcej časti.

Typ II

Reštrikčné endonukleázy typu II rozpoznávajú špecifické sekvencie DNA a štiepenie v konštantnej polohe blízko sekvencie, ktorá produkuje 5 'fosfáty a 3' hydroxyly. Ako kofaktory zvyčajne vyžadujú ióny horčíka (Mg ²⁺ ), ale niektoré z nich majú oveľa špecifickejšie požiadavky.

Štruktúrne sa môžu javiť ako monoméry, diméry alebo dokonca tetraméry. Rekombinantná technológia využíva endonukleázy typu II, a preto bolo charakterizovaných viac ako 3 500 enzýmov.

Typ III

Tieto enzymatické systémy sa skladajú z dvoch génov nazývaných mod a res, ktoré kódujú podjednotky, ktoré rozpoznávajú DNA, a modifikácie alebo obmedzenia. Obidve podjednotky sú potrebné na reštrikciu, čo je proces úplne závislý od hydrolýzy ATP.

Na štiepenie molekuly DNA musí enzým interagovať s dvoma kópiami nepalindromickej rozpoznávacej sekvencie a miesta musia byť na substráte v opačnej orientácii. Štiepeniu predchádza translokácia DNA.

Typ IV

V poslednej dobe bola identifikovaná ďalšia skupina. Systém sa skladá z dvoch alebo viacerých génov, ktoré kódujú proteíny, ktoré štiepia iba modifikované sekvencie DNA, buď metylované, hydroxymetylované alebo hydrometylované glukosyly.

Napríklad enzým EckKMcrBC rozpoznáva dva dinukleotidy všeobecnej formy RmC; purín, po ktorom nasleduje metylovaný cytozín, ktorý môže byť separovaný niekoľkými pármi báz - od 40 do takmer 3000. K štiepeniu dochádza asi 30 párov báz po mieste, ktoré enzým rozpoznáva.

Endonukleázy typu V

Endonukleázy tohto typu sú tiež známe ako "homing" endonukleázy. Tieto enzýmy rozpoznávajú a štiepia cieľovú DNA sekvenciu na jedinečných miestach v genóme zo 14 na 40 bp.

Tieto enzýmy sú často kódované v intrónoch a predpokladá sa, že ich funkciou je podpora horizontálneho prenosu rezaných sekvencií. Po orezaní nastane v DNA dvojitej špirále zlomová oprava založená na komplementárnej sekvencii.

Príklady

Endonukleáza I z E. coli pôsobí ako obranný systém proti fágu a parazitom. Nachádza sa hlavne medzi cytoplazmatickou membránou a bunkovou stenou. Vytvára dvojvláknové zlomy v cudzej DNA, s ktorou interaguje v periplazmatickom priestore.

Endonukleázy CRISPR-Cas sú enzýmy, ktoré pôsobia na obranný mechanizmus mnohých typov baktérií. Tieto identifikujú a odrezávajú špecifické sekvencie DNA od napadajúcich organizmov, ktorými sú zvyčajne vírusy.

Vedci z Massachusetts Institute of Technology (MIT) nedávno objavili systém úpravy genómu CRISPR-Cas12bm s vysokou presnosťou na modifikáciu ľudských buniek.

Referencie

1. Burrell, MM (vyd.). (1993). Enzýmy molekulárnej biológie. Totowa, NJ: Humana Press.
2. Loenen, WA, Dryden, DT, Raleigh, EA a Wilson, GG (2013). Reštrikčné enzýmy typu I a ich príbuzné. Research of Nucleic acid, 42 (1), 20-44.
3. Murray, PR, Rosenthal, KS, a Pfaller, MA (2017). Lekárska mikrobiológia + StudentConsult v španielčine + StudentConsult. Elsevier Health Sciences.
4. Nathans, D., & Smith, HO (1975). Reštrikčné endonukleázy v analýze a reštrukturalizácii molekúl DNA. Ročný prehľad biochémie, 44 (1), 273-293.
5. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. a Wende, W. (2005). Reštrikčné endonukleázy typu II: štruktúra a mechanizmus. Vedy o bunkových a molekulárnych životoch, 62 (6), 685.