CYTOCHÉMIA: HISTÓRIA, PREDMET ŠTÚDIA, UŽITOČNOSŤ A TECHNIKY - BIOLÓGIE - 2026

Cytochémiu zahŕňa množstvo techník, ktoré sú založené na identifikáciu a odstránenie špecifických látok vnútri bunky. Považuje sa za odvetvie bunkovej biológie, ktoré kombinuje morfológiu bunky s chemickou štruktúrou.

Podľa Bensleyho, zakladateľa aplikácie modernej cytologie, sa uvádza, že cieľom cytochémie je objaviť chemickú organizáciu buniek s cieľom porozumieť záhadám života. Rovnako ako štúdium dynamických zmien, ktoré sa vyskytujú počas rôznych funkčných fáz.

1: Pagetova mimamamárna choroba. (Hematoxylin-Eosin) 2: senilné plaky pozorované v mozgovej kôre u pacienta s Alzheimerovou chorobou. (Strieborná impregnácia) 3: Králikový jazyk, Kolagénové vlákna (modré). Svalové vlákna (fialové prúžky). (Massonov trichróm). 4: Pečeňové tkanivo s mastnou degeneráciou. (Sudan III) 5: Zápal pečene. Nekróza. (Toluidínová modrá) Zdroje: Wikipedia. com / Užívateľ: KGH / Public Domain Files / Mohit Lalwani

Týmto spôsobom je možné určiť metabolickú úlohu, ktorú tieto látky hrajú v bunke.

Cytochémia používa dve hlavné metódy. Prvý je založený na chemických a fyzikálnych postupoch. Tieto techniky využívajú použitie mikroskopu ako nevyhnutného nástroja na vizualizáciu chemických reakcií, ktoré sa vyskytujú na konkrétnych látkach v bunke.

Príklad: okrem iného použitie cytochemických farbív, ako je napríklad Feulgenova reakcia alebo PAS reakcia.

Druhá metóda je založená na biochémii a mikrochémii. Touto metodikou je možné kvantitatívne určiť prítomnosť intracelulárnych chemikálií.

Medzi látky, ktoré sa dajú odhaliť v tkanivovej alebo bunkovej štruktúre, patria: proteíny, nukleové kyseliny, polysacharidy a lipidy.

História cytochémie

Cytochemické techniky od svojho vynálezu pomohli pochopiť zloženie buniek a postupom času sa objavilo množstvo techník, ktoré používajú rôzne typy farbív s rôznymi podobnými afinitami a základmi.

Následne cytochémia otvorila nové horizonty s použitím určitých substrátov na kolorimetrické preukázanie prítomnosti enzýmov alebo iných molekúl v bunke.

Podobne sa objavili ďalšie techniky, ako je imunocytochémia, ktorá bola veľmi nápomocná pri diagnostike mnohých chorôb. Imunocytochémia je založená na reakciách antigén-protilátka.

Na druhej strane, cytochémia používa aj fluorescenčné látky nazývané fluórchrómy, ktoré sú vynikajúcimi markermi na detekciu určitých bunkových štruktúr. Vďaka vlastnostiam fluórchrómu zdôrazňuje štruktúry, ku ktorým je pripojený.

Čo študuješ?

Rôzne cytochemické techniky používané na biologickej vzorke majú niečo spoločné: odhaľujú prítomnosť konkrétneho typu látky a poznajú jej umiestnenie v hodnotenej biologickej štruktúre, či už ide o bunkový typ alebo tkanivo.

Týmito látkami môžu byť enzýmy, ťažké kovy, lipidy, glykogén a definované chemické skupiny (aldehydy, tyrozín atď.).

Informácie poskytované týmito technikami môžu poskytnúť návod nielen na identifikáciu buniek, ale aj na diagnostiku rôznych patológií.

Napríklad cytochemické farbivá sú veľmi užitočné pri rozlišovaní medzi rôznymi typmi leukémií, pretože niektoré bunky exprimujú určité enzýmy alebo kľúčové látky a iné nie.

Na druhej strane treba poznamenať, že na to, aby bolo možné použitie cytochémie, je potrebné vziať do úvahy tieto skutočnosti:

1) Látka sa musí imobilizovať na mieste, kde sa prirodzene nachádza.

2) Látka sa musí identifikovať pomocou substrátov, ktoré s ňou špecificky reagujú, a nie s inými zlúčeninami.

užitočnosť

Vzorky, ktoré je možné študovať pomocou cytochemických techník, sú:

- Rozšírená periférna krv.

- Predĺžená kostná dreň.

- tkanivá fixované pre histochemické techniky.

- Bunky fixované cytocentrifugáciou.

Cytochemické techniky sú vysoko podporné v oblasti hematológie, pretože sa široko používajú na pomoc pri diagnostike a diferenciácii určitých typov leukémií.

Napríklad: Esterázové reakcie sa používajú na rozlíšenie myelomonocytovej leukémie od akútnej monocytovej leukémie.

Šmuhy kostnej drene a periférnej krvi od týchto pacientov sú podobné, pretože niektoré bunky je ťažké morfologicky identifikovať samostatne. Za týmto účelom sa uskutoční esterázový test.

V prvom prípade sú špecifické esterázy pozitívne, zatiaľ čo v druhom nešpecifické esterázy sú pozitívne.

Sú tiež veľmi užitočné v histológii, pretože napríklad pri použití techniky farbenia ťažkých kovov (impregnácia striebrom) sa farbia retikulárne vlákna intenzívnej hnedej farby v tkanive myokardu.

Techniky v cytochémii

Najpoužívanejšie techniky budú vysvetlené nižšie:

- Použitie farbív

Použité škvrny sú v cytochemických technikách veľmi rozdielne a možno ich klasifikovať podľa niekoľkých hľadísk:

Podľa radikálu, ku ktorému majú afinitu

Rozdeľujú sa na: kyslé, zásadité alebo neutrálne. Sú to najjednoduchšie a najpoužívanejšie v histórii, čo nám umožňuje odlíšiť bazofilné zložky od acidofilných zložiek. Príklad: farbenie hematoxylínom-eozínom.

V tomto prípade sa jadrá buniek zafarbia na modro (berú hematoxylín, čo je základné farbenie) a cytoplazmy, červené (berú eozín, čo je kyslé farbenie).

Podľa farby, ktorú poskytujú

Môžu byť ortochromatické alebo metachromatické. Orthochromatiká sú tie, ktoré zafarbujú štruktúry rovnakej farby, akú má farbivo. Napríklad v prípade eozínu, ktorého farba je červená a sfarbuje sa červene.

Na druhej strane, metachromatická farba zafarbuje inú farbu ako ich, napríklad toluidín, ktorého farba je modrá a napriek tomu škvrna fialová.

Vitálne alebo supravitálne farbivá

Sú to neškodné farbivá, to znamená, že farbia bunky a zostávajú nažive. Tieto škvrny sa nazývajú vitálne (napr. Trypánová modrá na farbenie makrofágov) alebo supravital (napr. Janusova zelená na farbenie mitochondrií alebo neutrálna červená na farbenie lyzozómov).

- Detekcia lipidov pomocou tukových farbív

Oxid osmičelý

Zafarbí lipidy (nenasýtené mastné kyseliny) čierne. Túto reakciu je možné pozorovať pomocou svetelného mikroskopu, ale pretože toto farbivo má vysokú hustotu, je možné ho tiež vizualizovať elektrónovým mikroskopom.

Sudán III

Je to jeden z najpoužívanejších. Toto farbivo difunduje a solubilizuje v tkanivách a hromadí sa vo vnútri lipidových kvapiek. Farba je šarlátovo červená.

Morenie čierneho sudánu B

Vytvára lepší kontrast ako tie predchádzajúce, pretože sa dokáže rozpúšťať aj vo fosfolipidoch a cholesterole. Je užitočný na detekciu azurofilných a špecifických granúl zrelých granulocytov a ich prekurzorov. Preto identifikuje myeloidné leukémie.

- farbenie skupín aldehydov (farbenie Schiffovou kyselinou jodistou)

Farbenie Schiffovej kyseliny periodickej môže detekovať tri typy aldehydových skupín. Oni sú:

- Voľné aldehydy, ktoré sa prirodzene nachádzajú v tkanivách (reakcia v plazme).

- Aldehydy produkované selektívnou oxidáciou (reakcia PAS).

- Aldehydy generované selektívnou hydrolýzou (Feulgenova reakcia).

PAS reakcia

Toto farbenie je založené na detekcii určitých typov uhľohydrátov, ako je napríklad glykogén. Kyselina jodistá Schiff prerušuje CC väzby uhľohydrátov v dôsledku oxidácie glykolových skupín 1 - 2, čím sa uvoľňujú aldehydové skupiny.

Voľné aldehydové skupiny reagujú so Schiffovým činidlom a tvoria fialovočervenú zlúčeninu. Vzhľad fialovo-červenej farby vykazuje pozitívnu reakciu.

Tento test je pozitívny v rastlinných bunkách, ktorý deteguje škrob, celulózu, hemicelulózu a peptíny. V živočíšnych bunkách detekuje mucíny, mukoproteíny, kyselinu hyalurónovú a chitín.

Okrem toho je užitočný pri diagnostike lymfoblastických leukémií alebo erytroleukémie, okrem iných patológií myelodysplastického typu.

V prípade kyslých uhľohydrátov sa môže použiť farbenie alciánovou modrou. Test je pozitívny, ak sa pozoruje svetlo modrá / tyrkysová farba.

Plazmová reakcia

Plazmatická reakcia odhaľuje prítomnosť určitých alifatických aldehydov s dlhým reťazcom, ako je dlaň a stearal. Táto technika sa používa na zmrazené histologické rezy. Spracováva sa priamo Schiffovým činidlom.

Feulgénová reakcia

Táto technika zisťuje prítomnosť DNA. Táto technika spočíva v tom, že sa fixované tkanivo podrobí slabej kyslej hydrolýze, aby neskôr reagovalo so Schiffovým činidlom.

Hydrolýza vystavuje deoxyribózové aldehydové skupiny väzbe deoxyribóza-purín. Schiffove činidlo potom reaguje s aldehydovými skupinami, ktoré zostali voľné.

Táto reakcia je pozitívna v jadre a negatívna v cytoplazme buniek. O pozitivite svedčí prítomnosť červenej farby.

Ak je táto technika kombinovaná s metyl-zeleným pyronínom, je možné súčasne detekovať DNA a RNA.

- Cytochemické farbenie proteínových štruktúr

Na tento účel sa môže použiť Millonova reakcia, pri ktorej sa ako činidlo používa dusičnan ortuti. Štruktúry obsahujúce aromatické aminokyseliny sa zafarbia na červeno.

- Cytochemické škvrny, ktoré používajú substráty na preukázanie prítomnosti enzýmov

Tieto škvrny sú založené na inkubácii biologickej vzorky s určitým substrátom a produkt reakcie následne reaguje s diazoliami za vzniku farebného komplexu.

esterázy

Tieto enzýmy sú prítomné v lyzozómoch niektorých krviniek a sú schopné hydrolyzovať organické estery uvoľňujúce naftol. Posledne menované vytvára nerozpustné azofarbivo, keď sa viaže na diazo soľ, pričom zafarbí miesto, kde sa reakcia uskutočňuje.

Existuje niekoľko substrátov a v závislosti od toho, ktorý sa používa, je možné identifikovať špecifické esterázy a nešpecifické esterázy. Prvý z nich je prítomný v nezrelých bunkách myeloidnej série a druhý je v bunkách monocytového pôvodu.

Substrátom použitým na stanovenie špecifických esteráz je: naftol-AS-D chlóracetát. Zatiaľ čo na stanovenie nešpecifických esteráz sa môže použiť niekoľko substrátov, ako je naftol AS-D acetát, alfa-naftylacetát a alfa-naftylbutyrát.

Keď je reakcia pozitívna, v obidvoch prípadoch sa bunky zafarbia na tmavo červenú.

myeloperoxidázová

Tento enzým sa nachádza v azurofilných granulách granulocytárnych buniek a monocytov.

Jeho detekcia sa používa na rozlíšenie leukémií myeloidného pôvodu od lymfoidných. Bunky obsahujúce myeloperoxidázy zožltnú.

fosfatázy

Tieto enzýmy uvoľňujú kyseliny fosforečné z rôznych substrátov. Líšia sa navzájom podľa špecifickosti substrátu, pH a pôsobenia inhibítorov a inaktivátorov.

Medzi najznámejšie patria fosfomonoesterázy, ktoré hydrolyzujú jednoduché estery (PO). Príklad: alkalická fosfatáza a kyslá fosfatáza, ako aj fosfamidázy, ktoré hydrolyzujú väzby (PN). Používajú sa na rozlíšenie lymfoproliferatívnych syndrómov a na diagnostiku vlasatobunkovej leukémie.

- Trichromatické sfarbenie

Mallary-azánový trichróm

Sú užitočné na odlíšenie cytoplazmy buniek od vlákien spojivového tkaniva. Bunky zafarbia červenú a kolagénové vlákna modré.

Massonov trichróm

Toto má rovnaké využitie ako predchádzajúce, ale v tomto prípade bunky zafarbia na červeno a kolagénové vlákna sú zelené.

- Farbivá, ktoré zafarbujú konkrétne organely

Janus Green

Selektívne zafarbí mitochondrie.

Soli striebra a kyselina osmia

Zafarbí Golgiho aparát.

Toluidínová modrá

Stains Nissiho telá

Soli striebra a PAS

Zafarbia sietnicové vlákna a bazálnu laminu.

Resorcín orceínu a fuchsínu

Farbia elastické vlákna. Prvým sú zafarbené hnedo a druhým tmavomodré alebo fialové.

- Ostatné techniky používané v cytochémii

Použitie fluorescenčných látok alebo fluórchrómov

Existujú techniky, ktoré používajú fluorescenčné látky na štúdium umiestnenia štruktúry v bunke. Tieto reakcie sa vizualizujú špeciálnym mikroskopom nazývaným fluorescencia. Príklad: technika IFI (nepriama imunofluorescencia).

Detekcia bunkových komponentov pomocou imunocytochémie

Tieto techniky sú veľmi užitočné v medicíne, pretože pomáhajú detegovať určitú bunkovú štruktúru a tiež ju kvantifikovať. Táto reakcia je založená na reakcii antigén-protilátka. Napríklad: techniky ELISA (Enzyme Immuno Assay).

odporúčanie

- Na vyhodnotenie dobrého výkonu farbív je potrebné použiť kontrolné nátery.

- Na cytochemické farbenie by sa mali používať čerstvé nátery. Ak to nie je možné, mali by byť chránené pred svetlom a skladované pri 4 ° C.

- Je potrebné dbať na to, aby použitý fixačný prostriedok nemal nepriaznivý vplyv na látku, ktorá sa má skúmať. Inými slovami, musí sa zabrániť tomu, aby ho mohol extrahovať alebo inhibovať.

- Čas použitia fixačných prostriedkov sa musí rešpektovať, pretože vo všeobecnosti by mal trvať iba sekundy, pretože vystavenie náteru fixačnému prostriedku môže poškodiť niektoré enzýmy.

Referencie

1. "Cytochémiu." Wikipedia, slobodná encyklopédia. 30. júna 2018, 17:34 UTC. 9 Júl 2019, 02:53 Dostupné v: wikipedia.org
2. Villarroel P, de Suárez C. Metódy kovovej impregnácie pre štúdium myokardiálnych vláknitých vlákien: porovnávacia štúdia. RFM 2002; 25 (2): 224 - 230. K dispozícii na: scielo.org
3. Santana A, Lemes A, Bolaños B, Parra A, Martín M, Molero T. Cytochémia kyslej fosfatázy: metodologické úvahy. Rev Diagn Biol. 200; 50 (2): 89-92. K dispozícii na: scielo.org
4. De Robertis E, De Robertis M. (1986). Bunková a molekulárna biológia. 11. vydanie. Editorial Ateneo. Buenos Aires, Argentína.
5. Klasické nástroje na štúdium bunkovej biológie. TP 1 (doplnkový materiál) - Cell Biology. K dispozícii na adrese: dbbe.fcen.uba.ar