KMEŇ (MIKROBIÁLNY): CHARAKTERISTIKA, IDENTIFIKÁCIA, IZOLÁCIA - BIOLÓGIE - 2026

Mikrobiálne kmeň je sada potomkov z jednej mikrobiálne izolátu, ktorý sa pestuje v čistom prostredí, a je zvyčajne zložený z postupnosti organizmov, ktoré sú odvodené z rovnakého počiatočného kolónie.

Kmeň tiež predstavuje skupinu jedincov populácie mikrobiálnych druhov, ktoré zdieľajú určité fenotypové a / alebo genotypové vlastnosti, ktoré ho mierne odlišujú od ostatných tých istých druhov, ale ktorých rozdiely nie sú dostatočné na ich klasifikáciu ako rôznych druhov.

Fotografie Petriho misky s pevným kultivačným médiom doplneným antibiotikami, kde rastú rezistentné mikróby (Zdroj: Microrao / CC BY-SA (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0) prostredníctvom Wikimedia Commons)

Kmeň je „základom“ pre akúkoľvek mikrobiologickú štúdiu, pretože zaručuje vedcom, že parametre a charakteristiky, ktoré sa skúmajú pre druh mikróbov, sú špecifické iba pre tento druh. Okrem toho im to umožňuje určitým spôsobom zabezpečiť reprodukovateľnosť vyšetrovaní.

Napríklad pre taxonomické štúdie v mikrobiológii je prvým cieľom získanie „kmeňa“ organizmu, ktorý sa má klasifikovať, pretože týmto spôsobom je možné presne definovať každú z taxonomických charakteristík, ktoré rozlišujú túto podskupinu v rámci populácie jedného druhu alebo iného druhu mikróbov.

Kmeň umožňuje, aby bol druh mikróbov udržiavaný nažive a izolovaný in vitro na dlhú dobu, to je ďaleko od jeho prirodzeného prostredia. Môžu sa získať kmene mnohých mikroorganizmov rôznych typov, ako sú napríklad baktérie, huby, vírusy, prvoky, riasy.

Na udržanie kmeňov sa musia tieto kmene udržiavať v prísnej izolácii, ktorá zabráni kontaktu kmeňa s akýmkoľvek kontaminujúcim činidlom, ako sú napríklad plesňové spóry alebo s akýmkoľvek vonkajším mikroorganizmom.

Charakteristiky kmeňa

Všetky kmene, bez ohľadu na typ mikroorganizmu (druhu), ktorý reprezentujú, musia spĺňať niektoré základné parametre, medzi ktoré patria:

- Musia to byť stabilné genetické línie alebo musia mať vysokú genetickú vernosť

Je dôležité, aby všetci jedinci, ktorí zostávajú v kultivačnom médiu, boli čo najbližšie k sebe, geneticky povedané. To znamená, že všetky pochádzajú od toho istého jednotlivca alebo aspoň od tej istej populácie.

- Musí sa dať ľahko udržiavať alebo rásť

Jednotlivci patriaci do kmeňa sa musia dať ľahko udržiavať v prostredí in vitro. Inými slovami, nie všetky mikróby sa dokážu izolovať od svojho prirodzeného prostredia. Ak je ťažké ich pestovať v externých médiách, ich biológia sa dá ľahko zmeniť s minimálnymi zmenami prostredia, v ktorom sú udržiavané izolované v laboratóriu.

- Musia mať rýchly rast a vývoj v optimálnych podmienkach

Ak sa izolované mikróby v kultivačnom médiu použitom na tento účel nevyvíjajú rýchlo, je ťažké ich uchovať na štúdium, pretože za týchto podmienok môžu vyčerpať živiny zo svojho prostredia, zmeniť fázu alebo ohroziť ich prežitie. ,

- Musia vykazovať definované vlastnosti a parametre

Kmeň izolovaných mikroorganizmov musí mať spoločné vlastnosti, ktoré ho identicky a špecificky spájajú s jedincami, ktorí sú s ním totožní. Tieto charakteristiky musia byť v priebehu času konštantné.

- Ľahká manipulácia

Kmene používané pri rutinných výskumoch vo všeobecnosti nevyžadujú príliš prísne alebo komplikované nástroje alebo protokoly. To zaručuje, že tak študenti, ako aj noví vedci si môžu časom udržať kontinuitu štúdia.

ID

Molekulárna identifikácia

Existujú rôzne metódy na identifikáciu novo izolovaného kmeňa. V súčasnosti je však najpresnejšou, najrýchlejšou a najjednoduchšou technikou na určenie identity takmer akéhokoľvek druhu analýza niekoľkých oblastí genetických sekvencií, ktoré tvoria genóm jednotlivca.

Obvykle sa tieto analýzy uskutočňujú amplifikáciou špecifických oblastí DNA technikou PCR (polymerázová reťazová reakcia). Tieto techniky sa líšia podľa okraja, rodiny a typu mikroorganizmu, ktorého identita je požadovaná. Tieto regióny sú vo všeobecnosti:

- Regióny, ktoré kódujú ribozomálne RNA

- Gény kódujúce proteínové podjednotky, ktoré sa zúčastňujú respirácie (najmä ak je organizmus aeróbny)

- Genetická oblasť, ktorá kóduje aktínové mikrofilamenty (súčasť cytoskeletu)

- Niektoré genetické oblasti chloroplastov alebo proteínových podjednotiek, ktoré sa zúčastňujú fotosyntézy (pre niektoré riasy a cyanobaktérie a pre všetky rastliny)

Len čo sa tieto fragmenty genómu úspešne amplifikujú, sekvenujú sa, aby sa určilo poradie nukleotidov, ktoré tvoria tieto oblasti genómu. Toto sa uskutočňuje pomocou techník NGS (Next Generation Sequencing) so špecializovaným zariadením známym ako sekvencéry.

Sekvenované oblasti sa porovnávajú so sekvenciami mikroorganizmov tohto typu, ktoré už boli uvedené skôr, čo je možné napríklad pomocou databázy, ktorá je uložená na webovej stránke GenBank (https: // www. ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).

Morfologická identifikácia

V laboratóriách, ktoré nemajú nástroje molekulárnej biológie na analýzu genetických charakteristík, sa na identifikáciu kmeňov mnohých mikroorganizmov používajú iné fenotypické parametre. Fenotypické vlastnosti, ktoré sa skúmajú, sa opäť líšia v závislosti od organizmu, kmeňa, rodiny a uvažovaných druhov. Študujú sa tieto parametre:

- Morfologické vlastnosti mikróbov v kultivačnom médiu. Pozorované sú okrem iného: farba, tvar, štruktúra, typ rastu.

- Analýza metabolických produktov pomocou biochemických nástrojov. Študuje sa okrem iného výroba sekundárnych metabolitov, vylučovaných chemických zlúčenín.

- Charakterizácia a kryštalizácia proteínov. Vnútorné proteíny mikroorganizmov sa extrahujú a študujú nezávisle.

Typickou vecou v mikrobiologických štúdiách je vykonanie charakterizácie kmeňov s oboma typmi identifikácie, to znamená morfologickým pozorovaním a molekulárnou analýzou.

Izolácia kmeňov

Izolácia kmeňov zahŕňa niekoľko techník, ktoré sa používajú aj na oddelenie jedného druhu mikróbov od druhého. Schopnosť izolovať kmeň príslušného druhu je nevyhnutná na presné určenie jeho definujúcich charakteristík.

Väčšina techník izolácie kmeňa bola vytvorená v 19. storočí otcami mikrobiológie Louisom Pasteurom a Robertom Kochom. Obidve sa posadne snažili získať čisté bunkové kultúry (kmene) mikroorganizmov, ktoré študovali.

Zdroj: Sentebrinka / CC BY (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0) prostredníctvom Wikimedia Commons

Aby sa získali tieto bunkové kultúry, skúmali širokú škálu techník a nástrojov, od použitia sterilných špáradiel po variácie v zložení kultivačného média, v ktorom boli pripravené pestované mikróby.

Techniky izolácie kmeňa

V súčasnosti sa všetky techniky vyvinuté a používané týmito vedcami a niektoré modernejšie zozbierali do 6 rôznych typov, ktorými sú:

- Škrabance, škrabance alebo škrabance : pomocou jemného a špicatého nástroja sa dotkne miesta, kde sa nachádza mikroorganizmus (najmä pre kultúry pestované in vitro v pevnom médiu). Sterilné tuhé médium bohaté na živiny je poškriabané koncom, ktorým bol dotknutý mikroorganizmus.

- Ponorenie alebo fúzia do média : odoberie sa malá vzorka mikróbov (môže to byť ako vzorka odobratá v predchádzajúcej technike) a umiestni sa do rastového média v tekutom stave, pridá sa agar, ktorý stuhne a počkajte, až vychladne. Kolónie sa objavia iba vtedy, keď je mikroorganizmus vysoko rozvinutý.

- Sériové riedenia : vzorka z pôvodného miesta, kde bol druh zozbieraný, sa postupne riedi sterilným médiom bez iných mikroorganizmov. Riedenia sa naočkujú na pevné médium a očakáva sa, že sa objavia kolónie.

- Exkluzívne kultivačné médiá: sú to kultivačné médiá, ktoré umožňujú rast iba požadovaného typu mikróbov; to znamená, že obsahuje zložky alebo živiny, ktoré umožňujú len izoláciu rastu kmeňa.

- Ručné alebo mechanické oddelenie : umiestni sa malá vzorka mikróbu, ktorý sa má izolovať, a pomocou mikroskopu sa pokúsi oddeliť jediného jedinca druhu od ostatných jedincov, ktorí ho obklopujú.

Niektoré z týchto techník sú ľahšie použiteľné ako iné. Vedci ich však používajú podľa biologických charakteristík študovaného druhu.

Referencie

1. De Kruif, P. (1996). Lovci mikróbov. Houghton Mifflin Harcourt.
2. Dijkshoorn, L., Ursing, BM, a Ursing, JB (2000). Kmeň, klon a druh: pripomienky k trom základným konceptom bakteriológie. Journal of medical microbiology, 49 (5), 397-401.
3. Marx, V. (2016). Mikrobiológia: cesta k identifikácii na úrovni kmeňa. Nature Methods, 13 (5), 401-404.
4. Willey, JM, Sherwood, L. a Woolverton, CJ (2009). Prescottove princípy mikrobiológie. Boston (MA): McGraw-Hill Higher Education.
5. Williams, JA (vyd.). (2011). Kmeňové inžinierstvo: metódy a protokoly (zväzok 765, s. 389-407). New York: Humana Press.