VOGES-PROSKAUEROV TEST: ZALOŽENIE, PRÍPRAVA A POUŽITIE - BIOLÓGIE - 2025

Voges-Proskauerův test je biochemický testovací použitá na pomoc pri identifikácii baktérií čeľade Enterobacteriaceae. Je užitočný najmä na odlíšenie kmeňov Escherichia coli od Klebsiella a Enterobacter.

Test sa vykonáva v tekutom kultivačnom médiu s názvom Methyl Red - Voges Proskauer, ktoré je známe pod skratkou RM / VP. Toto médium sa skladá z pufrovaného polypeptidu, glukózy, fosforečnanu draselného a destilovanej vody.

Komerčné médium Methyl Red-Voges Proskauer (RM / VP) je pozitívne, resp. Negatívne. Zdroj: Fotografia zhotovená autorom MSc. Marielsa Gil / Sudipta.nov15, z Wikimedia Commons

Súčasné médium RM / VP je modifikáciou média Clarka a Lubsa, ktoré pôvodne obsahovalo nižšiu koncentráciu peptonov a glukózy. Takto sa vyrobilo menej vodíkových iónov potrebných na pozitívnu Voges-Proskauerovu reakciu.

Test je založený na schopnosti mikroorganizmu používať glukózu cestou butylén-glykol a tvoriť neutrálny konečný produkt nazývaný acetoín v prítomnosti kyslíka a zásaditého pH.

V médiu RM / VP sa okrem toho, že je možné odhaliť Voges-Proskauerov test, môže odhaliť aj test s metylovou červenou.

základ

Testovacia základňa Voges-Proskauer

Pluripeptony prítomné v médiu poskytujú základné nutričné ​​požiadavky na rast baktérií. Glukóza je hlavnou zlúčeninou. Mnoho baktérií má schopnosť metabolizovať glukózu a tvoriť kyselinu pyruvátovú.

Kyselina pyruvátová je stredobodom metabolizmu glukózy a odtiaľ každý mikroorganizmus môže ísť rôznymi spôsobmi. Niektoré budú tvoriť zmiešané kyseliny, ako je kyselina mliečna, kyselina octová, kyselina mravčia a kyselina jantárová, a iné budú tvoriť neutrálne produkty, ako je 2,3-butándiol.

Voges-Proskauerov test ukazuje schopnosť mikroorganizmu tvoriť acetylmetylkarbinol (acetoín), medziprodukt 2,3-butándiolu za aeróbnych podmienok.

Acetoín je redukovaný a tvorí 2,3-butándiol, ale táto reakcia je reverzibilná, takže ak sa 2,3-butándiol oxiduje, vytvorí sa acetoín. Preto je nevyhnutný kyslík.

Fosforečnan draselný je tlmivý roztok, ktorý tlmí zmes pri pH 6,9 ± 0,2.

Základ pre zverejňovanie a interpretáciu dôkazov

Na preukázanie reakcie sa musí vývoj vykonať pomocou dvoch reagencií (Barritove činidlá), známych ako Voges A a Voges B.

Voges A je 5% roztok a-naftolu a Voges B je 40% roztok hydroxidu draselného. Pokiaľ nie je k dispozícii hydroxid draselný, môže sa nahradiť 40% hydroxidom sodným.

Α-Naftol je katalyzátor, ktorý zvyšuje intenzitu reakčnej farby, čím sa test stáva citlivejším. A-naftol sa musí vždy pridávať ako prvý, trepaním skúmavky tak, aby sa médium dostalo do kontaktu s kyslíkom. Týmto spôsobom sa prítomný acetoín oxiduje na diacetyl a 2,3-butándiol sa oxiduje za vzniku acetoínu, ktorý prechádza na diacetyl.

Týmto spôsobom sa a-naftol viaže na diacetyl, ktorý sa zase pripojil k guanidínovému jadru prítomnému v aminokyseline arginínu, pričom ten pochádza z pluripeptonov.

Pre jeho časť, draselný alebo hydroxid sodný, je zodpovedný za absorpciu CO _2, a reakciou s peptóny. Táto reakcia spôsobuje tvorbu lososovo ružovej farby, ktorá je zreteľne viditeľná po veľmi dobre pretrepaní skúmavky.

Aby sa farba okamžite objavila, musí sa zmiešať správne množstvo diacetylu, peptónu a a-naftolu. Ak sa tak nestane, skúmavka sa nechá pred tlmočením ponechať v pokoji 15 minút.

Test je zvyčajne pozitívny po 2 až 5 minútach, keď je vidieť slabá ružová farba. Ak sa nechá stáť 30 minút až 1 hodinu, intenzita farby bude maximálna (intenzívna červená).

Keď vývar zožltne, objaví sa negatívny test. Po 1 hodine, ak je test negatívny, sa v dôsledku reakcie hydroxidu draselného na a-naftol môže vytvoriť medená farba.

príprava

Stredná MR / VP

Naváži sa 17 g dehydratovaného kultivačného média a rozpustí sa v litri destilovanej vody. Nechajte pôsobiť 5 minút. Zahrejte sa do varu, aby sa úplne rozpustil. Podávajte 3 až 4 ml v skúmavkách a sterilizujte v autokláve pri 121 ° C po dobu 15 minút.

Dehydratované kultivačné médium má béžovú farbu a pripravené médium má svetlú jantárovú farbu.

Konečné pH média je 6,9 ​​± 0,2.

Vogesovo činidlo

Odváži sa 5 g a-naftolu a rozpustí sa v 50 ml etylalkoholu (absolútne). Potom pokračujte v pridávaní etylalkoholu, až kým nedosiahne 100 ml.

Činidlo Voges B

Navážte 40 g hydroxidu draselného a rozpustite v 50 ml destilovanej vody v kadičke. Sklo sa musí umiestniť do kúpeľa so studenou vodou na kontrolu teploty, pretože keď sa prípravok rozpustí, teplota prudko stúpa.

Po ochladení sa roztok prenesie do odmernej banky a doplní sa destilovanou vodou na 100 ml.

Postup skúšky Voges-Proskauer

Na vykonanie testu Voges-Proskauer sa živná pôda RM / VP naočkuje študovaným mikroorganizmom z čistej kultúry na 18 až 24 hodín.

Inokulum by nemalo byť veľmi husté. Inkubuje sa pri 35 - 37 ° C počas 24 až 48 hodín, hoci niekedy je nevyhnutná inkubácia po dobu niekoľkých dní. Cowan a Steel sa domnievajú, že minimálna doba inkubácie potrebná na odhalenie všetkých pozitívnych druhov Voges-Proskauer (VP) z čeľade Enterobacteriaceae je 5 dní.

Vývoj testu

Oddeľte alikvotnú časť s objemom 1 ml do skúmavky a vyvíjajte sa takto: Vložte 12 kvapiek (0,6 ml) činidla Voges A a 4 kvapky (0,2 ml) Voges B. Premiešajte, aby sa prevzdušnil a nechajte usadiť. po dobu 5 - 10 minút pred tlmočením. Ak je však test stále negatívny, nechajte ho sedieť a skúmavku sledujte po 30 minútach až 1 hodine.

Vzhľad ružovkastočervenej farby naznačuje, že reakcia Voges-Proskauer je pozitívna. Ak médium zostane žlté, reakcia je negatívna.

Aby sa predišlo falošným negatívom, je nevyhnutné pridať vývojárov v uvedenom poradí a množstve.

použitie

Voges-Proskauerov test je užitočný na rozlíšenie medzi kmeňmi E. coli, ktoré sú VP negatívne, rodov Klebsiella, Enterobacter, Serratia, okrem iného, ​​ktoré sú VP pozitívne.

Zdroj: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vydanie. Editorial Panamericana SA Argentína.

QA

Kontrolné kmene sa môžu použiť na testovanie kvality pripraveného média, vrátane Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium a Enterobacter cloacae ATCC 13047.

Očakávané výsledky sú pozitívne Voges-Proskauerove reakcie iba pre K. pneumoniae a E. cloacae. Zvyšok dáva negatívne reakcie.

Referencie

1. Britannia Laboratories. MR-VP Medium. 2015.K dispozícii na: www.britanialab.com
2. Microkit Laboratories. M-Ident Voges Proskauer. 2014. K dispozícii: http://www.medioscultivo.com
3. Mac Faddin J. (2003). Biochemické testy na identifikáciu baktérií klinického významu. 3. vydanie. Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentína.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentína.
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vydanie. Editorial Panamericana SA Argentína.