OXIDÁZOVÝ TEST: ZDÔVODNENIE, POSTUP A POUŽITIE - BIOLÓGIE - 2026

Test oxidáza je diagnostická metóda, ktorá ukazuje prítomnosť enzýmu komplexu s názvom cytochróm oxidázy c. Tento systém indukuje transformáciu redukovaného cytochrómu na oxidovanú, pretože zachytáva kyslík a to zase pôsobí ako posledný akceptor elektrónov (H ⁺ ) v dýchacom reťazci.

Termín oxidáza je skratka na označenie enzýmu cytochróm oxidáza, tiež známa ako indofenol oxidáza. V dávnych dobách sa verilo, že enzýmy cytochróm oxidáza a indofenol oxidáza sú dva rôzne enzýmy, ale dnes sú známe, že sú rovnaké.

Pozitívny a negatívny oxidázový test. Zdroj: Nebol poskytnutý žiadny strojom čitateľný autor. Predpokladané Alpha.prim ~ commonswiki (na základe nárokov na autorské práva).

Cytochrómy sú hemoproteíny, ktoré obsahujú železo a dopĺňajú systém cytochróm oxidázy. Cytochrómy sa môžu líšiť od druhu k druhu.

Existujú rôzne odrody cytochrómov (cytochrómy al, a2, a3 a 0). Niektoré baktérie môžu produkovať iba jednu, ale iné až dve alebo tri naraz. V tomto zmysle je prítomnosť cytochrómu a a a3 známa ako cytochróm oxidáza c. Toto je typ cytochrómu, ktorý detekuje test oxidázy.

Rod Neisseria a Pseudomonas obsahujú cytochróm oxidázu c. Tieto rody dávajú pozitívny oxidázový test, ktorý ich pomáha odlíšiť od rodov Acinetobacter a Stenotrophomonas.

Existujú aj iné rody, ktoré sú pozitívne na oxidázu.

základ

Charakteristiky systému cytochróm oxidázy c

Systém cytochróm oxidázy c funguje nasledujúcim spôsobom: mikroorganizmy pozitívne na oxidázu využívajú kyslík na výrobu energie prostredníctvom aeróbneho dýchania. Tento systém funguje vďaka transportu elektrónov z donorových látok, ako je NADH ^+, na receptorové látky, v tomto prípade kyslík.

To vedie k produkcii energie (ATP) a vody alebo peroxidu vodíka v závislosti od systému cytochróm oxidázy, ktorý mikroorganizmus vlastní.

Z tohto dôvodu je väčšina baktérií pozitívnych na oxidázu pozitívna aj na katalázu, čo je nevyhnutná podmienka na odstránenie vzniknutého peroxidu vodíka, pretože táto látka je pre baktérie toxická.

Systém cytochróm oxidázy c je prítomný v niektorých aeróbnych baktériách, niektorých fakultatívnych anaeróboch, niekoľkých mikroaerofilných a bez prísnych anaeróbov. Posledné uvedené je pochopiteľné, pretože prísne anaeróby nemôžu žiť v prítomnosti kyslíka, a preto im chýba systém cytochróm oxidázy.

Princíp skúšky

V tomto teste sa používajú látky, ktoré pôsobia ako umelé akceptory elektrónov a nahrádzajú prírodné v rámci reťazca prenosu elektrónov.

Používajú sa hlavne farbivá, ako je parafenyléndiamín a indofenol, ktoré pôsobia ako substráty receptorov a umelé donory elektrónov.

Parafenyléndiamín je oxidovaný systémom cytochróm oxidázy c. Farbivo v redukovanej forme je bezfarebné, ale v oxidovanej forme je sfarbené.

Takto sa preukáže prítomnosť systému cytochróm oxidázy c; pretože pozitívna reakcia vytvorí levanduľovú alebo modro-fialovú farbu v závislosti od použitého činidla.

Na druhej strane, ak sa posledná látka prijímajúca elektróny v dýchacom reťazci líši od kyslíka, oxidázový test bude negatívny (nedochádza k tvorbe farby); to je prípad anaeróbnych mikroorganizmov.

Podobne, ak sa cytochróm používaný mikroorganizmom líši od cytochróm oxidázy c, dá sa tiež negatívny test.

proces

Na oxidázový test existujú rôzne činidlá a protokoly, to všetko na ten istý účel.

reagents

Činidlo Kovacs, činidlo Gordon a McLeod, činidlo Nadi, Carpenter, Suhrland a Morrison, a použitie oxidázových diskov.

-Kovacs oxidázové činidlo

Skladá sa z 1% tetrametyl-p-fenyléndiamín dihydrochloridu.

Kovacsovo činidlo sa pripravuje rozpustením 1 g vyššie uvedenej látky v 50 ml destilovanej vody. Jemne sa zahrieva, až kým sa úplne nerozpustí. Preneste do jantárovej fľaše s dostatočnou kapacitou a objem doplňte destilovanou vodou na 100 ml. Pred použitím počkajte najmenej 15 minút. Uchovávajte v chladničke chránenej pred svetlom.

Je označený ako Kovacs oxidázové činidlo na odlíšenie od Kovacsovho činidla použitého na odhalenie indolového testu. Toto činidlo je najcitlivejšie, menej toxické, ale je drahšie ako zvyšok činidiel.

S týmto reagentom sa preukáže pozitívna reakcia so zmenou farby kolónií na levanduľa, ktorá rýchlo zmení farbu na fialovú až čiernu. Negatívna reakcia je zrejmá, pretože nedochádza k žiadnym zmenám farby kolónií alebo má mierne ružovkastú farbu. Médium môže tiež stmavnúť, ale to neznamená pozitívnu reakciu.

Pri tomto reakčnom činidle je rozhodujúci reakčný čas, zmena farby, ktorá nastane medzi 5 až 15 sekundami, sa považuje za pozitívnu reakciu.

-Gordon a McLeodovo činidlo

Skladá sa z dihydrochloridu dimetyl-p-fenyléndiamínu, tiež známeho ako N-dimetyl-p-fenyléndiamín alebo monohydrochlorid p-aminodimetylanilínu. Pripraví sa tak, ako je opísané pre Kovacs oxidázové činidlo, pričom nahradí príslušnú látku.

Toto činidlo je o niečo stabilnejšie ako činidlo Kovacs oxidázy, hoci všetky činidlá obsahujúce p-fenyléndiamín sú nestabilné.

Táto reakcia je neskôr, je interpretovaná ako pozitívna s výskytom modro-fialovej farby do 10 až 30 minút.

-Nadi činidlo

Skladá sa z 1% a-naftolu v etylalkohole (95% etanolu) a 1% aminodimetylanilínu. Zmes sa pripravuje v rovnakých dieloch a za použitia absolútneho etylalkoholu ako riedidla, kým sa nedosiahne dostatočné množstvo na 100 ml.

- Činidlo pre stolár, Suhrland a Morrison

Skladá sa z 1% oxalátu p-aminodimetylalanínu. Pripraví sa rovnakým spôsobom, ako je opísané pre Kovacsovo oxidázové činidlo, pričom sa zmení zodpovedajúca látka.

S pripraveným roztokom sa testovacie prúžky pripravia nasledujúcim spôsobom: 6-8 cm prúžky filtračného papiera Whatman No. 1 sa impregnujú 1% dimetyl-p-fenyléndiamín oxalátovým činidlom.

Nechajú sa vyschnúť bez kontaktu s kovom, skladujú sa v pohárov so skrutkovacím uzáverom so sušidlom a uchovávajú sa v chladničke. Tieto prúžky sú stabilné až 6 mesiacov.

Je to najstabilnejšie činidlo zo všetkých uvedených látok a môže trvať až 6 mesiacov v roztoku. Ďalším plusovým bodom je, že nezafarbí médium okolo kolónie, ak sa použije priamo na doštičku.

Vzhľad červenej farby sa interpretuje ako pozitívny test.

-Oxidázové disky

Sú to komerčné disky, ktoré sú impregnované činidlom na oxidázový test. Na trhu existuje niekoľko komerčných značiek.

Jeho použitie je celkom praktické, pretože nie je potrebné pripravovať čerstvé činidlá, čo uľahčuje prácu. Získané výsledky sú spoľahlivé, pokiaľ sú disky správne uchované.

protokoly

Metóda priamej doštičky, nepriama metóda na papieri a použitie diskov napustených oxidázovými činidlami.

-Smernica priamym spôsobom

2 alebo 3 kvapky ktoréhokoľvek z vyššie uvedených činidiel sa na tento účel pridajú priamo na kolóniu (kolónie) obsiahnuté v doštičke kultivačného média, ktoré neobsahuje glukózu.

Interpretácia alebo zmena farby kolónií nie je interpretovaná ako médium. Platný reakčný čas závisí od použitého činidla.

- Nepriama metóda na papieri

Vystrihnite kúsok filtračného papiera (Whatman č. 1) na veľkosť 6 cm ² a vložte ho do prázdnej Petriho misky.

Pridajte na papier 2 alebo 3 kvapky činidla Kovacs oxidázy, zúčastnite sa kolónie, ktorá sa má študovať, pomocou platinovej rukoväte alebo dreveného špáradla a rozložte ju v priamke na papieri impregnovanom činidlom. Tlmočiť do 5 až 10 sekúnd.

S prúžkami pripravenými s Carpenterovým, Suhrlandovým a Morrisonovým činidlom sa na suchý pásik nanesie kolónia. Jeden prúžok sa používa na testovanie niekoľkých kmeňov. Tlmočenie do 10 s.

-Disky (m

Komerčné disky jemne navlhčite sterilnou destilovanou vodou a vrstvu na kolónii, ktorá sa má študovať. Odporúča sa používať platničky pri 35 ° C, ak sa používajú platničky pri izbovej teplote alebo chladené platne, reakcia je trochu pomalšia. Interpretujte zmenu farby medzi 10 a 20 sekundami.

Môžu sa použiť kolónie obsiahnuté v krvi alebo čokoládovom agare.

- Disky (nepriama metóda)

Navlhčite disk, ako už bolo opísané. Vložte ju do prázdnej Petriho misky. Vezmite dostatočné množstvo kolónie na štúdium pomocou platinovej rukoväte alebo dreveného špáradla a umiestnite ju na disk. Interpretujte zmenu farby medzi 10 a 20 sekundami.

použitie

Rod Neisseria a Acinetobacter sú niekedy morfologicky veľmi podobné, pretože aj keď je rod Acinetobacter gram-negatívnou tyčinkou, môže mať niekedy formu kokoidov a môže byť distribuovaný v pároch, čo simuluje rod Neisseria.

V tomto prípade je oxidázový test skutočne užitočný. Rod Neisseria je pozitívny a Acinetobacter negatívny.

Rod Moraxella je však veľmi podobný rodu Neisseria a obidve dávajú pozitívnu reakciu; Z tohto dôvodu sa na definitívnu identifikáciu musia vždy vykonať fermentačné testy uhľovodíkov.

Na druhej strane je oxidázový test užitočný na rozlíšenie baktérií patriacich do čeľade Enterobacteriaceae (všetky oxidáza negatívne) od iných fermentorov, ako je rod Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (oxidáza pozitívna).

Rod Vibrio a Helicobacter je tiež pozitívny na oxidázu.

QA

Ako negatívnu kontrolu použite známe kmene Escherichia coli a ako pozitívnu kontrolu kmene Pseudomonas aeruginosa.

obmedzenia

- Činidlá sa musia používať čerstvo pripravené, ich skladovateľnosť v roztoku pri izbovej teplote je krátka, pretože sú veľmi nestabilné. Chladené môžu trvať 5 až 2 týždne.

- Činidlá sú bezfarebné, ak zmenia farbu, musia sa zlikvidovať. Poškodené disky sa objavia, pretože časom stmavnú.

- Pozitívna reakcia s Kovacs oxidázovým činidlom medzi 15 - 60 s sa považuje za oneskorenú reakciu a po 60 sekundách by sa mala považovať za negatívnu.

-Hememophylus influenzae vykazuje negatívnu oxidázovú reakciu, ak sa použije akékoľvek činidlo s dimetyl-p-fenyléndiamínom, ale pozitívne, ak sa použije Kovacsovo oxidázové činidlo (tetrametyl-p-fenyléndiamín).

- Médiá obsahujúce glukózu interferujú s testom, čo vedie k falošne negatívnym výsledkom.

- Kmene Bordetella pertussis môžu spôsobiť falošne pozitívnu reakciu, ak pochádzajú z vysoko koncentrovaných platní na krvný agar.

- Použitie kovových (železných) úchytiek dáva falošne pozitívnu reakciu.

odporúčanie

- Pretože sú činidlá veľmi nestabilné a majú sklon k oxidácii, odporúča sa zmraziť alikvóty s objemom 1 až 2 ml a podľa potreby ich odstrániť.

- Ďalším spôsobom, ako oddialiť autooxidáciu činidla, je pridať 0,1% kyseliny askorbovej pri príprave reagencií.

- Pretože sú reagencie nestabilné, odporúča sa týždenná kontrola kvality.

- Nemali by sa používať korytnačky, ktoré neprešli testom kontroly kvality.

Referencie

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vydanie. Editorial Panamericana SA Argentína.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentína.
3. "Oxidázový test." Wikipedia, slobodná encyklopédia. 15 január 2018, 10:32 UTC. 3. apríla 2019, 14:03
4. Svetová zdravotnícka organizácia. Laboratórna príručka na identifikáciu a testovanie citlivosti bakteriálnych patogénov na verejné zdravie v rozvojových krajinách na antimikrobiálne látky. K dispozícii na adrese: who.int/drugresistance/infosharing
5. Reagenčné prúžky na diagnostiku aktivity oxidázy v baktériách. Rev Cubana Med Trop. 2000; 52 (2): 150 - 151.