KATALÁZOVÝ TEST: ZDÔVODNENIE, TECHNIKA A POUŽITIE - BIOLÓGIE - 2026

Test kataláza je metóda používa v bakteriologických laboratóriách ukazujú na prítomnosť enzýmu katalázy v tých baktérií, ktoré ju mať. Spolu s Gramovým farbením sú hlavnými testami, ktoré by sa mali vykonať na novo izolovaných mikroorganizmoch. Tieto testy vedú mikrobiológa k krokom, ktoré sa majú vykonať pri konečnej identifikácii príslušného mikroorganizmu.

Všeobecne platí, že baktérie obsahujúce cytochróm majú enzým kataláza, to znamená, že by ho mali mať aeróbne a fakultatívne anaeróbne baktérie. Existujú však výnimky, ako napríklad Streptococcus, ktoré napriek tomu, že sú fakultatívnymi anaeróbnymi mikroorganizmami, neobsahujú enzým kataláza.

Vykonanie testu katalázy, ktoré vykazuje pozitívnu reakciu. Zdroj: Nebol poskytnutý žiadny strojom čitateľný autor. Predpokladaná Nase (na základe nárokov na autorské práva).

Preto sa katalázový test používa predovšetkým na rozlíšenie rodov Staphylococaceae a Micrococaceae (obidve katalázy pozitívne) od rodiny Streptococaceae (katalázy negatívne).

Podobne sa rod rod Bacillus (kataláza pozitívny) odlišuje od rodu Clostridium (kataláza negatívny).

základ

Kataláza je enzým klasifikovaný ako hydroperoxidase, to znamená, že použitie peroxidu vodíka (H ₂ O ₂ ) ako substrátu .

Považuje sa tiež za oxidoreduktázu, pretože pri reakcii, kde sa zúčastňuje, existuje prvok, ktorý slúži ako donor elektrónov (redukujúca látka) a druhý ako receptor elektrónov (oxidačná látka).

Kataláza je proteín, ktorý obsahuje proserickú skupinu so štyrmi trojmocnými atómami železa (Fe ⁺⁺⁺ ), preto je to homoproteín. Železitý ión zostáva počas reakcie oxidovaný.

Dá sa povedať, že kataláza je detoxikačný enzým, pretože jej funkciou je eliminácia látok, ktoré sa tvoria pri bakteriálnom metabolizme toxických pre baktérie. Medzi tieto látky patrí peroxid vodíka.

Peroxid vodíka je tvorený aeróbnym rozkladom cukrov. Tento proces nastáva nasledovne:

Superoxidové ion (O ₂ ^- ) (voľný radikál) je vytvorený ako konečný produkt asimiláciu glukózy aeróbne cestou. Je to toxické a vylučuje sa enzýmom superoxiddismutáza, ktorá ho premieňa na plynný kyslík a peroxid vodíka.

Peroxid vodíka je toxický aj pre baktérie a musí sa odstrániť. Enzým kataláza rozkladá peroxid vodíka na vodu a kyslík.

Kataláza môže pôsobiť na iné substráty ako peroxid vodíka, ako sú alkoholy, aldehydy, kyseliny, aromatické amíny a fenoly. Peroxid vodíka sa však môže tiež použiť katalázou na oxidáciu ďalších toxických zlúčenín, ako je metyl a etylalkohol.

Kataláza je tiež prítomná vo fagocytárnych bunkách, čo ju chráni pred toxickým pôsobením peroxidu vodíka.

Rutinná technika pre katalázový test

-Skĺzavá metóda

materiály

3% peroxid vodíka (10 objemov).

Mikroskopické sklíčko

Jednorazová plastová rukoväť alebo špáradlo.

proces

Vezmite dostatok kolónie na štúdium bez toho, aby ste sa dotkli agaru, z ktorého pochádza. Kolónia musí byť čerstvá, tj z kultúry od 18 do 24 hodín.

Umiestnite kolóniu na suchú snímke a pridať kvapku 3% peroxidu vodíka k nej ( 30% H ₂ O ₂ môže byť tiež použitý ). Okamžite sledujte, či sa bubliny uvoľňujú alebo nie.

interpretácia

Pozitívna reakcia: vývoj plynu, ktorý sa prejavuje tvorbou bublín (silné bublanie).

Negatívna reakcia: nedochádza k tvorbe bublín.

- Priama metóda v čistej kultúre

Miesto 1 ml 3% H ₂ O ₂ na čisto tanier alebo klinového kultúry, ktoré neobsahuje krv (s výhodou Živný agar). Okamžite sledujte, či dochádza k tvorbe bublín. 30% H ₂ O ₂ môžu byť taktiež použité .

Je interpretovaný rovnako ako metóda objektu porta.

-Metóda s kapilárnou trubicou alebo Fungom a Petrishkom

Naplňte kapilárnu skúmavku s priemerom 67 mm do výšky 20 mm kapilárou s 3% peroxidom vodíka.

Dotykom na izolované kolónie, ktoré majú byť študované kapiláry naplnené s 3% H ₂ O _{2 .} Pozorujte, či sa kapilára do 10 sekúnd naplní bublinami. Táto metóda umožňuje semikvantifikáciu reakcie na kríži:

Bez krížov neexistujú bubliny (negatívna reakcia).

+ ---- Málo bublín (slabá alebo oneskorená reakcia).

++ --– Veľké bubliny (mierna reakcia).

+++ - Guľôčky sa dostanú na opačný koniec (silná reakcia).

- Taylorova a Achanzarova metóda pre katalázové testy, ktoré vyvolávajú pochybnosti

Umiestnite izolované kolónie na čistú, suchú sklíčko, potom miesto kvapku 0,5% H ₂ O ₂ a krytom s krycím sklíčkom. Dbajte na to, či vzniknú zachytené bubliny.

Interpretácia: prítomnosť bublín naznačuje pozitívnu reakciu. Žiadne bubliny, interpretuje sa ako negatívna reakcia.

Katalázový test na druhy Mycobacterium

Táto technika sa musí vykonať reguláciou pH a teploty. Musí sa vykonávať pod laminárnym prúdením, pretože manipulácia s rôznymi druhmi Mycobacterium je nebezpečná.

-Materials

Peroxid vodíka 30% alebo 110 objemov (superoxal).

Fosfátový pufor pH 7

10% Tween 80

Kultivácia klinov Mycobacterium po dobu 3 až 4 týždňov

-Preparation

Fosfátový pufor pH 7

Vážiť:

1,361 g z bezvodého fosforečnanu monodraselného (KH ₂ PO ₄ ).

1,420 g bezvodého hydrogenfosforečnanu sodného (Na2HP03).

Obidve soli rozpustite v troche sterilnej destilovanej vody a doplňte vodou na 1000 ml.

10% Tween 80

Na Tween 80, ktorý je komerčne koncentrovaný, urobte riedenie 1:10, postupujte takto:

Vezmite 1 ml Tween 80 a vložte ho do trochu destilovanej vody, rozpustite a potom doplňte objem vodou na 10 ml.

Konečné činidlo

Zmiešajte množstvo fosfátového tlmivého roztoku s množstvom 10% Tween 80 (rovnaké diely). Definujte v laboratóriu, koľko chcete pripraviť.

-Process

Vložte 5 ml fosfátového tlmivého roztoku do sterilnej skúmavky s uzavretým uzáverom (bakelit).

Pomocou očkovacej slučky odoberte dostatok kolónií rastu Mycobacterium naočkovaných do klinov a rozpustite sa vo fosfátovom tlmivom roztoku.

Rúrku uzavrite bez nadmerného utiahnutia závitu. Vložte na 20 až 30 minút do vodného kúpeľa pri 68 ° C. Vyberte a nechajte vychladnúť na 22-25 ° C

Odmerajte 0,5 ml konečného činidla (premiešajte) a pridajte ho do skúmavky so studeným roztokom. Sledujte tvorbu bublín alebo nie.

Je interpretovaný rovnako ako predchádzajúce techniky.

použitie

Ak sa v obohatených médiách dosiahne rast kolónií, na získaných kolóniách by sa malo vykonať Gramovo farbenie a test s katalázou. Toto usmerní mikrobiológa o postupoch, ktoré sa majú dodržiavať pri konečnej identifikácii.

Zdroj: Pripravil autor MSc. Marielsa gil

QA

Na vyhodnotenie dobrého výkonu peroxidu vodíka použite čerstvo kultivované kontrolné kmene, ako napríklad Staphylococcus aureus ako pozitívnu kontrolu, a kmene Streptococcus sp ako negatívnu kontrolu.

Inou alternatívou, ktorá slúži ako pozitívna kontrola, je umiestniť kvapku peroxidu vodíka na krvný agar, erytrocyty majú katalázu, preto ak dôjde k dobrej reakcii činidla, dôjde k prebublávaniu.

Ako negatívna kontrola sa môže použiť čokoládový agar, kde sú erytrocyty už lyzované a test je negatívny.

obmedzenia

- Nepoužívajte na test staré kultúry, pretože to môže spôsobiť falošné negatívy.

- Vyvarujte sa odoberaniu kolónií z kultúr na krvný agar, ak sa nedotýkate agaru; Tento postup môže viesť k falošne pozitívnym výsledkom, pretože červené krvinky obsahujú katalázu.

-Ak beriete kolóniu s platinovou rukoväťou, nemeňte poradie postupu, pretože to môže viesť k falošne pozitívnym výsledkom. Je to preto, že platina je schopná reagovať s peroxidom vodíka, čo spôsobuje bublanie.

- Nepoužívajte peroxid vodíka, ak je veľmi staré, pretože je veľmi nestabilné a má sklon sa časom rozkladať.

-Udržujte peroxid vodíka proti svetlu a chlade, aby nedošlo k jeho poškodeniu.

- Pri každom použití vykonajte kontrolu kvality peroxidu vodíka.

Take do úvahy, že v prípade 30% H ₂ O ₂ sa používa, reakcia sú silnejšie ako tie, ktoré vykonáva s 3% H ₂ O ₂ .

Referencie

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vydanie. Editorial Panamericana SA Argentína.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentína.
3. Mac Faddin J. (2003). Biochemické testy na identifikáciu baktérií klinického významu. 3. vydanie. Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentína.
4. Laboratóriá BD. Činidlo Catalase-Gotario. K dispozícii na adrese: http://winklerltda.cl
5. Laboratóriá Vadequímica. Peroxid. Rovnocennosť medzi objemami a percentom. K dispozícii na adrese: vadequimica.com