NEGATÍVNE ZAFARBENIE: ZDÔVODNENIE, TECHNIKA, VÝHODY A NEVÝHODY - BIOLÓGIE - 2026

Negatívne farbenie je metóda špeciálna sfarbenie upozorniť na prítomnosť kapsule v niektorých mikroorganizmov , najmä Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae a Cryptococcus neoformans-, z klinických vzoriek alebo čistých kultúr.

Priama vzorka bežne používaná na aplikovanie negatívneho zafarbenia je mozgomiešna tekutina. Táto technika predstavuje rýchlu alternatívu pre predpokladanú diagnózu meningitídy, najmä Cryptococcus neoformans.

A. Zubný kameň zafarbený atramentom Indie, B. Cryptococcus neoformans var gatti slabo opuzdrený, ako sa vyskytuje v prírode, s použitím nigrosínu. C. Cryptococcus neoformans var gatti s hustou kapsulou, ktorá sa nachádza v jej parazitickej forme, s použitím nigrosínu. D. Cryptococcus neoformans s mierne riedenou indickou farbou. Gisell Quinde, od Wikimedia Commons / CDC, cez Wikimedia Commons / Foto Kredit: Poskytovatelia obsahu: CDC / Dr. Leanor Haley, prostredníctvom Wikimedia Commons

Podobne sa toto farbenie môže aplikovať na sputum a sterilné tekutiny všeobecne, ako aj na kmene získané z mladých čistých kultúr. Táto technika používa na jej vykonanie nigrozínový alebo indický atrament; preto je to veľmi jednoduchá a lacná metodika, ktorá poskytuje informácie s veľkou diagnostickou hodnotou v krátkom čase.

V tomto zmysle je akékoľvek farbenie schopné vykonať toto farbenie. Laboratórium musí mať, samozrejme, kompetentný personál schopný rozoznať izolované alebo pučiace kvasinky Cryptococcus neoformans a odlíšiť ich od leukocytov a artefaktov, ktoré môže vzorka obsahovať.

základ

Atrament Nigrosine a India pracuje podobným spôsobom; preto sa jedna z týchto dvoch látok môže používať zameniteľne.

Táto technika sa nazýva negatívne zafarbenie, pretože pôsobí v rozpore so zvyškom zafarbovacích techník. V tomto ostáva nepotrestaná štruktúra, ktorá je hľadaná alebo ktorú si želáme vidieť; to znamená mikroorganizmy.

Preto je zafarbenie založené na zafarbení spodnej časti náteru tmavou farbou. V tomto scenári budú kapsulované štruktúry vynikať svetlou alebo bezfarebnou farbou.

Kvasinky sú spravidla refringentné, obklopené čírym halogénom, ktorý zodpovedá kapsule. K tomu dochádza preto, že indický atrament a nigrosín sú látky, ktoré nie sú schopné preniknúť do polysacharidu, ktorý tvorí kapsulu živých mikroorganizmov.

Je potrebné poznamenať, že iné štruktúry, ktoré môžu byť prítomné v priamej vzorke, ako napríklad leukocyty alebo červené krvinky, tiež neprenikajú.

Ak sú však mikroorganizmy mŕtve, farbivo môže v nich preniknúť, takže toto zafarbenie je tiež užitočné na vyhodnotenie životaschopnosti mikroorganizmov.

technika

materiály

nigrosinové

Nigrosine vďačí za svoj názov čiernej farbe, ktorú má. Je to syntetická látka, ktorá sa získava zahrievaním zmesi organických zlúčenín - napríklad nitrobenzínu, anilínu a anilínhydrochloridu - použitím katalyzátora (železo alebo meď) v uvedenej reakcii.

Čínsky atrament

Čínsky atrament je látka, ktorú používajú najmä Aziati na písanie, výrobu umeleckých diel a monochromatické maľovanie. V čínskej kultúre je veľmi populárny.

Získava sa z kalmej farby zmiešanej s práškovým dreveným uhlím, produktom horenia stromov s nízkou živicou.

Je tiež možné ho pripraviť zo sadzí zo spaľovania uhľovodíkov (rastlinných olejov) spolu s proteínovou želatínou, ktorá mu dáva správnu konzistenciu, aby sa zabránilo zrážaniu uhlíkových častíc.

Špecifikácie odberu vzoriek

- Nevyžaduje sa pôst.

- Vzorka CSF, spúta alebo sterilnej tekutiny musí obsahovať najmenej 1 ml objemu a musí sa okamžite preniesť do laboratória pri izbovej teplote.

- Vzorky CSF a sterilných tekutín musí odoberať špecializovaný lekár.

- Môže to byť aj čistá kultúra podozrivého kmeňa spojeného s vyššie uvedenými patogénmi.

Vykonanie techniky s priamymi vzorkami

- Vzorky sa musia odstrediť, potom sa supernatant zlikviduje a odoberie sa sediment.

- Kvapalina odstredeného materiálu (sediment) a kvapka indického atramentu alebo nigrosínu sa umiestnia na čisté podložné sklíčko.

- Mal by byť dobre premiešaný a zakrytý krycou vrstvou, aby sa kvapka mohla šíriť ako tenká fólia bez toho, aby presahovala okraje.

- Následne sa prípravok nasadí na mikroskop.

- Ak je prípravok príliš tmavý, môže sa zriediť vodou.

Vykonanie techniky kmeňmi z kultúry

- Veľmi malá časť mladej kultúry sa odoberie očkovacou ihlou a rozpustí sa v kvapke indického atramentu predtým umiestneného na čisté podložné sklíčko.

- Krycí sklíčko je umiestnené na vrchu.

- Pozoruje sa v mikroskope 10x a potom 40x.

Časť kolónie môžete tiež rozpustiť v destilovanej vode a odtiaľ kvapku premiešať s indickým atramentom. Týmto spôsobom prípravok nebude taký hrubý, čo umožní pozorovať štruktúry izolovane; ak sú davy ľudí, nebude sa to dobre pozorovať.

Ďalšou metodikou je:

- Položte kvapku suspenznej kultúry na jeden koniec podložného sklíčka.

- Na rovnaký koniec dajte kvapku nigrozínu a premiešajte.

- Pomocou ďalšieho sklíčka rozložte vzorku tak, ako by vytvorila hematologický náter.

- Nechajte uschnúť a pozorujte pod mikroskopom.

Pozorovanie mikroskopom

Najprv musíte zaostriť s 10x objektívom, aby ste mali široký výhľad na pole. Následne by sa malo hľadať, či sú voľné miesta; ak existujú, zaostrite 40x a zobrazte podrobnosti.

výhoda

- Je ľahké vykonať.

- Je to lacná technika.

- Táto metóda nevyžaduje, aby bol náter pripevnený na teplo alebo chemickými látkami; preto sa mikroorganizmy pozorujú bez skreslenia.

- Čerstvý prípravok sa nemusí sušiť, takže ho možno okamžite pozorovať a rýchlo získať výsledky.

nevýhoda

Po zostavení sa čerstvé prípravky musia okamžite sledovať; ak sa nechá uschnúť, už ich nie je možné pozorovať a musí sa nainštalovať nový.

Farbenie tkanív indickým atramentom

Ďalšou funkciou, ktorú môže atrament z Indie splniť, sú patologické laboratóriá. Toto sa aplikuje na chirurgicky extrahované vzorky tkaniva, aby sa vyznačili resekčné okraje nádoru.

Značené tkanivo sa postrieka kyselinou octovou. To pôsobí ako moridlo a zabraňuje úniku atramentu, keď je tkanivo podrobené rutinnému spracovaniu na prípravu biopsie.

Procedúra spočíva v kúpaní tkaniva v alkohole a xyléne a následnom namočení do parafínového vosku. Toto označenie vedie patológa pri pozorovaní tkaniva a naznačuje, kde je chirurgická resekčná marža alebo iné zaujímavé miesto.

Referencie

1. «Nigrozín». Wikipedia, slobodná encyklopédia. 11. júla 2017, 22:46 UTC. 6. januára 2019, 16:56: en.wikipedia.org
2. „Čínsky atrament“. Wikipedia, slobodná encyklopédia. 1. októbra 2018, 03:08 UTC. 6. januára 2019, 18:20: es.wikipedia.org/
3. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J a spolupracovníci. (2006). Pracovný personál autonómnej komunity Extremadura. Osobitný program Zväzok IV. Redakčné MAD. Seville-Španielsko, str. 211-212.
4. Silva M., García M., Corrales J., Ponce E. (2006), špecialista laboratórneho technika, Galician Health Service (SERGAS). Objem špecifického predmetu programu 2. Redakčný MAD. Sevilla-Španielsko, str. 79-80.
5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Argentína. Editorial Panamericana SA