ZIEHL-NEELSENOVO FARBENIE: ZDÔVODNENIE, ČINIDLÁ A TECHNIKA - BIOLÓGIE - 2026

Ziehl-Neelsenovo farbiaci technikou pre identifikáciu mikroorganizmov rezistentné kyseliny s alkoholom (ARA). Názov tohto mikrobiologického postupu sa týka jeho autorov: bakteriológa Franza Ziehla a patológa Friedricha Neelsena.

Táto technika je typom diferenciálneho farbenia, ktoré vyžaduje použitie rôznych farbív, aby sa vytvoril kontrast medzi štruktúrami, ktoré chcete pozorovať, diferencovať a neskôr identifikovať. Farbenie Ziehl-Neelsen sa používa na identifikáciu určitých typov mikroorganizmov.

Ziehl-Neelsenovo farbenie

Niektoré z týchto organizmov sú mykobaktérie (napr. Mycobacterium tuberculosis), nocardia (napr. Nocardia sp.) A niektoré jednobunkové parazity (napr. Cryptosporidium parvum). Mnoho baktérií možno klasifikovať bežnou technikou nazývanou Gramovo farbenie.

Niektoré bakteriálne skupiny však vyžadujú iné metódy, aby ich bolo možné identifikovať. Techniky, ako je Ziehl-Neelsenovo farbenie, si vyžadujú kombináciu farbív s teplom, aby sa fixačné činidlo pripevnilo na bunkovú stenu.

Potom nasleduje bieliaci proces, ktorý umožňuje dva výsledky: odolnosť alebo citlivosť na odfarbenie kyselinami a alkoholmi.

základ

Zdôvodnenie tejto farbiacej techniky je založené na vlastnostiach bunkovej steny týchto mikroorganizmov. Stena je tvorená typom mastných kyselín nazývaných kyseliny mykolové; Tieto sa vyznačujú veľmi dlhými reťazcami.

Ak majú mastné kyseliny veľmi dlhé štruktúry, môžu ľahšie zadržiavať farbivá. Niektoré bakteriálne rody sa veľmi ťažko farbia Gramovým farbením kvôli vysokému obsahu mykolových kyselín v bunkovej stene.

Farbenie Ziehl-Neelsen používa fenolovú zlúčeninu karbol fuchsín, základné farbenie. To má schopnosť interagovať s mastnými kyselinami bunkovej steny, ktorá je pri izbovej teplote voskovitá.

Farbenie karbolu fuchsínu je zvýšené v prítomnosti tepla, pretože sa topí vosk a molekuly farbiva sa pohybujú rýchlejšie do bunkovej steny.

Kyselina, ktorá sa používa neskôr, slúži na odfarbenie buniek, ktoré neboli zafarbené, pretože ich stena nebola dostatočne spojená s farbivom; preto je sila kyslého bielidla schopná odstrániť kyslé farbivo. Bunky, ktoré odolajú tejto zmene sfarbenia, sa nazývajú rýchle.

Sekundárne farbivo

Po odfarbení vzorky sa kontrastuje s iným farbivom nazývaným sekundárne farbivo. Všeobecne sa používa metylénová modrá alebo malachitová zelená.

Sekundárne farbivo zafarbí materiál na pozadí a následne vytvára kontrast so štruktúrami, ktoré boli zafarbené v prvom kroku. Iba sfarbené bunky absorbujú druhé farbivo (kontrastné farbenie) a nadobúdajú svoju farbu, zatiaľ čo bunky s rýchlym pôsobením kyselín si zachovávajú svoju červenú farbu.

Tento postup sa často používa na identifikáciu Mycobacterium tuberculosis a Mycobacterium leprae, ktoré sa nazývajú acidorezistentné bacily.

reagents

Primárne farbivo

Používa sa 0,3% karbol fuchsínu (filtrovaného). Toto farbivo sa pripravuje zo zmesi alkoholov: fenolu v etanole (90%) alebo metanolu (95%) a v tejto zmesi sa rozpustia 3 gramy bázického fuchsínu.

Bieliaci roztok

V tomto kroku sa môžu použiť roztoky 3% kyseliny alkoholickej alebo 25% kyseliny sírovej.

Sekundárne farbivo (kontrafarbivo)

Farbivo, ktoré sa najčastejšie používa na porovnanie vzoriek, je obvykle 0,3% metylénová modrá. Môžu sa však použiť aj iné, napríklad 0,5% malachitovej zelene.

technika

Postup značenia kyselinou rýchlo

Pripravte bakteriálny náter

Tento prípravok sa robí na čistom a suchom podložnom sklíčku podľa opatrení týkajúcich sa sterility.

Sušenie rozmazaním

Nechajte náter zaschnúť pri izbovej teplote.

Vzorku zahrejte

Vzorka by sa mala zahriať pôsobením ohňa na podložné sklíčko nižšie. Fixáciu alkoholom je možné vykonať, ak náter nebol pripravený spútom (ošetrený chlórnanom sodným na jeho bielenie) a ak sa nezačne okamžite farbiť.

M. tuberculosis sa odstráni bielidlom a počas procesu farbenia. Tepelná fixácia nespracovaného spúta nezabije M. tuberculosis, zatiaľ čo fixácia alkoholom je baktericídna.

Škvrnu zakryte

Škvrna je pokrytá roztokom karbolu fuchsínu (primárne základné farbenie).

Zahrejte škvrnu

Toto sa vykonáva po dobu 5 minút. Mali by ste si všimnúť vývoj pary (približne 60 ° C). Je dôležité neprehriať sa a vyhnúť sa spáleniu vzorky.

Pokiaľ ide o zahrievanie škvŕn, pri zahrievaní karbol fuchsínu by sa mala venovať veľká pozornosť, najmä ak sa vyfarbenie uskutočňuje na podnose alebo inej nádobe, v ktorej boli zozbierané vysoko horľavé chemikálie z predchádzajúceho vyfarbenia.

Pod sklíčka sa má použiť iba malý plameň pomocou predtým osvetleného tampónu navlhčeného niekoľkými kvapkami kyslého alkoholu, metanolu alebo 70% etanolu. Nepoužívajte veľký tampón namočený v etanole, pretože to predstavuje nebezpečenstvo požiaru.

Umyte škvrnu

Toto pranie sa musí vykonať čistou vodou. Ak voda z vodovodu nie je čistá, umyte škvrnu s výhodou filtrovanou alebo destilovanou vodou.

Zakryte náterom kyslým alkoholom

Tento kyslý alkohol by mal byť 3%. Pokrytie sa vykonáva po dobu 5 minút alebo dokiaľ nie je náter dostatočne sfarbený, t.j. svetloružová.

Je potrebné vziať do úvahy, že kyslý alkohol je horľavý; preto sa musí používať s veľkou starostlivosťou. Vyhnite sa blízkosti zdrojov zapálenia.

Umyte škvrnu

Umývanie by sa malo vykonávať čistou destilovanou vodou.

Zakryte škvrnu

Môže to byť malachitovo zelené zafarbenie (0,5%) alebo metylénová modrá (0,3%) na 1 alebo 2 minúty, pri dlhšom čase, ak je náter riedky, použite dlhší čas.

Umyte škvrnu

Opäť by sa mala použiť čistá (destilovaná) voda.

Na odtok

Zadnú časť podložného sklíčka by ste mali vyčistiť a škvrnu umiestniť na drenážny stojan, aby sa mohla vysušiť na vzduchu (na sušenie nepoužívajte absorpčný papier).

Skúmajte náter pod mikroskopom

Musí sa použiť objektív a imerzný olej 100X. Systematicky skenujte náter a zaznamenajte príslušné pozorovania.

Interpretujte výsledky

Teoreticky sa mikroorganizmy, ktoré zafarbujú červenkastú farbu, považujú za acidorezistentné pozitívne (AAR +).

Naopak, ak sa mikroorganizmy zafarbia na modro alebo zeleno, v závislosti od farbiva použitého ako kontrastné farbivo, považujú sa za acidorezistentné negatívne (AAR-).

Referencie

1. Apurba, S. & Sandhya, B. (2016). Základy praktickej mikrobiológie (1. vydanie). Jaypee Brothers Medical Publishers.
2. Bauman, R. (2014). Mikrobiológia s chorobami podľa tela (4. vydanie). Pearson Education, Inc.
3. Heritage, J., Evans, E. & Killington, A. (1996). Úvodná mikrobiológia (1. vydanie). Cambridge University Press.
4. Morello, J., Granato, P. Wilson, M. & Morton, V. (2006). Laboratórny manuál a pracovný zošit v mikrobiológii: Aplikácie v starostlivosti o pacientov (11. vydanie). McGraw-Hill Education.
5. Vasanthakumari, R. (2007). Učebnica mikrobiológie (1. vydanie). Publikácie BI PVT.