WRIGHTOVO FARBENIE: ZDÔVODNENIE, MATERIÁLY, TECHNIKA A POUŽITIE - BIOLÓGIE - 2026

Wright škvrna je farbenie technika vytvorený americkou patológom James Homer Wright v roku 1902, na základe škvrnu Romanowského. Pretože Romanowsky farbenie bolo nestabilné, Wright začlenil metanol ako rozpúšťadlo a fixačné činidlo.

Toto sfarbenie je polychromatické, čo znamená, že vytvára niekoľko farieb v závislosti od štruktúry, ktorá absorbuje farbivo. Táto farbiaca technika sa široko používa na vykonávanie diferenciálneho počtu bielych krviniek a na štúdium morfológie červených krviniek, krvných doštičiek a leukocytov v periférnej krvi a kostnej dreni.

Rôzne periférne krvné škvrny zafarbené Wrightovým farbivom. A. Akútna leukémia B. Plasmodium vivax vo vnútri erytrocytov. C. Plasmodium falciparum, makrogametocyt. D. Lymfocyty

Jeho použitie je veľmi dôležité, pretože v rôznych bunkových líniách krvi je možné pozorovať abnormality, čo uľahčuje diagnostiku chorôb, ako je leukémia alebo bakteriálne alebo parazitárne infekcie.

Možno ide o najbežnejšie aplikácie, v ktorých sa táto technika používa, nie sú však jediné. Je tiež užitočný vo vzorkách iných ako krv a kostná dreň, ako je napríklad výtok z nosa, fekálny hlien, sputum, vzorky kože.

Odôvodnenie Wrightovej škvrny

Wrightovo farbenie sa zrodilo z Romanowského farbenia, ktoré pozostáva z roztoku metylalkoholu kyslého farbiva (eozín Y) a zásaditého farbiva (metylénová modrá) a ich oxidačných produktov.

Zmes farbív použitých vo Wrightovom farbení spôsobuje účinok známy ako Romanowsky, to znamená, že dodáva jadru leukocytov a neutrofilných granúl nádherné fialové sfarbenie, zatiaľ čo červené krvinky sfarbujú ružovú farbu.

Zložky zodpovedné za poskytnutie typického farebného spektra Wrightovho farbenia sú modrá B a eozín Y. Pozorovaný účinok bude závisieť od väzby farbív k chemickým štruktúram a interakcií modrej B a eozínu Y.

Kyslé štruktúry, ako sú nukleové kyseliny, jadrové proteíny a reaktívna nezrelá cytoplazma niektorých typov buniek, fixujú modrú B (základné farbenie).

Zatiaľ čo základné štruktúry, ako je hemoglobín, sa granuly segmentovaných eozinofilov viažu okrem iných bunkových štruktúr na eozín Y (kyslé farbivo).

Výsledok zafarbenia môže byť ovplyvnený rôznymi faktormi, ako je napríklad pH Wrightovho farbiva, tlmivý roztok a premývací roztok; ako aj čas farbenia a fixácie.

Preto je každý krok pri príprave reagencií rozhodujúci a musí sa uskutočňovať so zreteľom na všetky podrobnosti.

materiály

Wrightova škvrna. Na 100 ml sa vyžaduje:

Navážte 0,3 g Wrightovho farbiva, odmerajte 97 ml metanolu a 3 ml glycerolu.

príprava

Do malty umiestnite veľké množstvo Wrightovho farbiva a postupne pridávajte glycerol, až kým sa prášok úplne nerozpustí.

Následne sa pridá metanol, zmes sa vleje do jantárovej fľaše.

Pred použitím je potrebné roztok jemne pretrepať a prefiltrovať.

Pufrovaný tlmivý roztok

V jednom litri destilovanej vody, 3,76 g dvojsodnej soli hydrophosphate (Na ₂ HPO ₄ 2 H ₂ 0) a 2,1 g dihydrogénfosforečnanu draselného (KH ₂ PO ₄ sa pridá).

Miešajte veľmi dobre, až kým sa všetky zabudované činidlá nerozpustia. Upravte pH na 7,2. Nalejte do pohára a udržiavajte pri izbovej teplote.

Na vykonanie vyfarbenia sú potrebné ďalšie materiály

Ďalej sú potrebné ďalšie materiály, aby boli schopné vykonávať farbiacu techniku, sú to: sklíčka alebo kryty predmetov, mostík na farbenie, tričká s vodou alebo tlmivým roztokom na pranie, časovač na udržanie časov sfarbenia a nejaký sušiaci materiál. (savý papier, gáza alebo bavlna).

Súčasti Wrightovej škvrny

metanol

Alkohol (metanol) slúži ako fixácia krvného náteru na sklíčko.

V podstate ide o koagulačné činidlo redukujúce, dehydratujúce a fixačné. Jeho funkciou je preto koagulovať proteíny a urobiť ich nerozpustnými, ale bez toho, aby boli skutočne denaturované.

Metanol je najčastejšie používaným fixačným činidlom vo všetkých laboratóriách, pretože poskytuje lepšie výsledky ako etanol. Ideálna koncentrácia je 99%.

tlmič

Tlmivý roztok (tlmivý roztok) má funkciu úpravy alebo udržiavania pH farbiva, pretože pH upravené na 7,2 je nevyhnutné pre bunkové štruktúry, aby boli schopné správne absorbovať farbivá.

Na druhej strane krok fixácie metanolom dehydratuje bunky a tlmivý roztok im pomáha ich rehydratovať.

Eosin (Y)

Eozín má afinitu k stavebným blokom, pretože je kyslým farbivom. Dva typy eozínu sú navzájom veľmi podobné, a to natoľko, že je možné použiť ktorýkoľvek z nich, pričom sa získa rovnaký výsledok.

Jeden sa nazýva eozín Y, žltý eozín alebo tetrabromofluoresceín a druhý sa nazýva eozín B, namodralý erytrozín B alebo dibromodinitrofluoresceín. Najčastejšie sa však používa eozín Y.

Najdôležitejšou vlastnosťou tohto farbiva je jeho negatívna polarita, vďaka ktorej je priťahovaná k pozitívne nabitým bunkovým štruktúram.

Metylénová modrá

Je to základné sfarbenie. Jeho hlavnou vlastnosťou je metachromázia, to znamená, že nie všetky štruktúry budú zafarbené rovnakou farbou, záleží na chemickom zložení štruktúr, ktoré sú farbené.

Niektoré z nich zmenia farbu na svetlo alebo tmavomodrú a iné na tmavofialovú alebo svetlo fialovú.

technika

1 - Vykonajte rozloženie vzorky tak, aby zostal tenký film, buď na sklíčku alebo na krycom sklíčku.

2 Nechajte schnúť na vzduchu asi 2 hodiny.

3 - Suchý náter umiestnite na farbiaci mostík alebo misku na farbenie tak, aby vzorka smerovala nahor.

4-List zakryte kvapkou Wrightovej škvrny po kvapkách, až kým nebude zakrytý celý povrch. Nechajte pôsobiť 5 - 8 minút.

5-Škvrna by mala úplne zakrývať podložné sklíčko bez rozliatia cez okraje. Ak sa počas sfarbenia začne vyparovať, pridajte niekoľko ďalších kvapiek.

6 - Následne pridajte rovnaké množstvo tlmiča nárazov, jemne fúkajte, kým sa neobjaví charakteristický kovový lesk. Čas 10 až 15 minút.

7-Opláchnite vodou z vodovodu a jemný prúd umiestnite tak, aby plachta vyzerala ružovo.

8 - S gázou namočenou v alkohole odstráňte farbivo prilepené k zadnej časti sklíčka.

9 - Pred umiestnením ponorného oleja ho nechajte veľmi dobre zaschnúť, aby ste ho videli pod mikroskopom.

užitočnosť

hematológie

Je ideálny na farbenie náterov z periférnej krvi, na vyšetrenie hrubých krvných náterov a na štúdium buniek zo vzoriek kostnej drene.

Vďaka chemickým vlastnostiam tejto kombinácie farbív je možné ľahko rozoznať bunkové štruktúry a rozlíšiť rôzne prítomné typy buniek.

Rýma

Táto technika je veľmi užitočná na identifikáciu buniek nazálneho výboja (epitelové bunky, segmentované eozinofily, polymorfonukleárne bunky) pri diagnostike alergickej rinitídy.

parazitológia

V tomto zmysle je to užitočné pri štúdiu Leishmania sp v histiocytoch subkutánneho bunkového tkaniva v kožných vredoch. Podobne sa používa na identifikáciu leukocytov vo vzorkách stolice (fekálny leukogram).

V tomto prípade je zaujímavé, aby lekár vedel, či je leukocytóza prítomná v stolici polymorfonukleárna alebo mononukleárna. Toto zistenie vo fekálnom leukograme povedie, či ide o bakteriálnu alebo vírusovú infekciu.

Na druhej strane parazity cirkulujúce v krvi sa nachádzajú v erytrocytoch alebo sú voľné v plazme. Hľadanými parazitmi sú Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii a filariae a vo veterinárnej medicíne je užitočná pri hľadaní Theileria equi a Babesia caballi, pôvodcov bebesiózy, najmä u koní.

Farbenie Wright a tiež farbenie Giemsa umožňujú rozlíšiť hemoparazity od normálnych bunkových komponentov. Na tento účel je možné použiť dva typy nátierok:

Spread tenký

Krv sa šíri ako tenký film na podložné sklíčko. Je zafarbená Wrightovým farbením, odhaľujúcim vlastnosti jadra a cytoplazmy.

Hustá kvapka

Táto metodika sa používa na skúmanie prítomnosti parazitov vo väčšom množstve krvi.

Na tento účel sa na podložné sklíčko umiestni veľká kvapka krvi. Akonáhle tam je, musí byť defibrilovaný, robiť väčšie a väčšie kruhy od stredu smerom von, pomocou okraja iného diapozitívu.

Nakoniec, aby bolo možné pozorovať parazity v hrubom nátere, musia sa erytrocyty lýzovať vodou.

Respiračné infekcie

Na úrovni dýchania je táto technika tiež užitočná, pretože bunky prítomné vo vzorkách spúta, výplachu priedušiek alebo priedušiek sú dôležité na stanovenie diagnózy.

Podobne tu možno rozlíšiť polymorfonukleárne bunky a mononukleárne bunky.

bakteriológie

Použitie tejto techniky v bakteriológii je obmedzené, pretože nie je dobré na farbenie baktérií, a preto sa na farbenie používajú iné špecializované techniky farbenia.

Používa sa však na vyhľadávanie epitelových buniek s inklúznymi telieskami Chlamydia trachomatis v stenách močovej trubice alebo endocervikálnej sliznice, hoci sa musí uznať, že to nie je najlepšia metóda.

Je tiež možné pozorovať špirálovité baktérie, ako je Borrelia burgdorferi, medzi červenými krvinkami infikovaných pacientov, ako aj morula alebo inklúzne telieska Ehrlichia sp v cytoplazme lymfocytov, monocytov alebo neutrofilov v krvnom nátere.

mykológia

Histoplasma capsulatum je patogénna huba, ktorá sa často diagnostikuje mikroskopickým pozorovaním rôznych vzoriek tkanív, zafarbených Wrightovým farbením.

Ako sa pozoruje štruktúra vzorky krvi pri Wrightovom farbení?

Zdroj: Retamales E, Mazo V. Inštitút verejného zdravia, vláda Čile. Odporúčania na farbenie krvných náterov na odčítanie hemogramu.

Odporúčania pre dobré zafarbenie

Sklíčka na vzorky krvi by mali spontánne schnúť na vzduchu. Na dosiahnutie lepšej fixácie farbiva a zabránenie nadmernému zafarbeniu by mali byť nátery čo najtenšie.

Pre vysoko kvalitné zafarbenie sa odporúča zafarbiť do dvoch hodín od prípravy náteru. Na druhej strane ideálnou vzorkou je kapilárna krv bez antikoagulantu.

Ak sa však použije žilová krv, mala by sa používať ako antikoagulačná EDTA a nie heparín, pretože táto môže deformovať bunkové štruktúry.

Aby sa zabránilo znehodnoteniu pripraveného farbiva, malo by sa skladovať na suchých miestach.

Počas procesu prania sa odporúča používať vodu upravenú na neutrálne pH.

Nakoniec je vhodné čas od času testovať farbiace metódy používané v laboratóriu.

To sa robí zafarbením vzoriek alebo rozšírených vzorov ako kontroly kvality. Tento krok je dôležitý, pretože zaisťuje, že farbenie je správne pripravené a časy farbenia sú dobre štandardizované.

Ak je vzorka slabo zafarbená, musia sa vyriešiť problémy.

Časté chyby pri Wrightovom farbení

Veľmi svetlé zafarbenie

Veľmi svetlé škvrny sú zvyčajne dôsledkom veľmi krátkej doby zafarbenia alebo nadmerného prania. Koriguje sa predĺžením doby kontaktu s farbivom alebo skrátením doby prania.

Zráža sa farbivo

Prítomnosť zrazenín farbiva v nátere môže mať niekoľko príčin, najčastejšie sú však tieto príčiny: použitie nefiltrovaného farbiva, zafarbenie na nerovnomerných zafarbovacích mostíkoch, použitie zašpinených dosiek prachom alebo mastnotou, nie dobré pranie úplné zafarbenie.

Extrémne červený alebo modrý náter

Pufr je zodpovedný za pH farbiva. Farbivá s pH nižším ako je uvedené (kyslé) ​​spôsobia veľmi červenkasté škvrny.

Ak je pH farbiva nad (zásadité), výsledkom bude extrémne namodralý náter.

Režim ukladania

Činidlo by sa malo skladovať pri izbovej teplote.

Referencie

1. Gutiérrez V. Porovnávacia štúdia medzi metódou Wrightovho farbenia a testom Elisa na diagnostiku psej ehrlichiózy v meste San Pedro Sula v Hondurase. 2008. Diplomová práca, ktorá má nárok na titul veterinárny lekár. Univerzita v San Carlos v Guatemale.
2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Základné škvrny v mikrobiologickom laboratóriu. Výskum zdravotného postihnutia. 2014; 3 (1): 10-18.
3. "Wrightova škvrna." Wikipedia, slobodná encyklopédia. 18. mája 2018, 12:05 UTC. 8. decembra 2018, 20:37
4. Calderón A, Cardona J, Vergara Ó. Frekvencia Babesia spp. v poľovníckych koňoch, Córdoba (Kolumbia). Rev. udcaactual divulgient. 2013; 16 (2): 451 - 458.
5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Argentína. Editorial Panamericana SA
6. Retamales E, Mazo V. Inštitút verejnej správy v Čile. Odporúčania na farbenie krvných náterov na odčítanie hemogramu.