FARBENIE HEMATOXYLÍNU-EOZÍNU: CHARAKTERISTIKA, POUŽITIE, TECHNIKY - CHÉMIA - 2025

Hematoxylin - eozín je farbenie technika využívajúca kombináciu farbív hematoxylínom a eozín. Táto dvojica farbív vytvára perfektné duo, pretože hematoxylín pôsobí ako zásadité farbivo a eozín je kyslé farbivo.

Označenie zásaditých alebo kyslých farbív sa netýka pH, ktoré získavajú v roztoku, ale skôr hovorí o prevládajúcom pomere, pokiaľ ide o aniónové alebo katiónové náboje, ktoré majú alebo o umiestnenie chromoforovej skupiny.

Hematoxylin - eozín (HE) zafarbený stĺpovitý stĺpcový epitel Zdroj: Todd Straus a Vladimir Osipov

V tomto zmysle je hematoxylín považovaný za zásadité (katiónové) farbivo, a preto má afinitu k kyslým štruktúram, ako je napríklad jadro buniek. Zatiaľ čo eozín, ktorý je kyslým (aniónovým) farbivom, má afinitu k alkalickým alebo zásaditým štruktúram, ako je bunková cytoplazma.

Z tohto dôvodu sa táto kombinácia farbív široko používa na farbenie tkanív, pretože umožňuje zreteľné rozlíšenie jadier a cytoplaziem. Jadrové zafarbenie tmavo modré alebo fialové a cytoplazma ružová.

Farbenie hematoxylínom-eozínom je jednou z najpoužívanejších farbiacich techník v oblasti histológie a cytologie vďaka svojej ľahkej manipulácii a nízkej cene. Používa sa okrem iného na vizualizáciu buniek, hustých nervových vlákien a prítomnosti určitých mikroorganizmov v tkanivách, ako sú: parazity, huby a baktérie.

vlastnosti

hematoxylín

Hematoxylín je neutrálne farbivo. Zložka poskytujúca farbu (chromofor) sa však nachádza v katiónovom alebo základnom strede molekuly. Preto je jeho afinita k kyslým štruktúram. Jeho chemický vzorec je C ₁₆ H ₁₄ O ₆ a jeho vedecký názov je 7,11b-dihydroindeno chromen-3, 4,6a, 9,10 (6 H) -pentol.

Zafarbí hlavne jadrá buniek, pretože sú veľmi bohaté na nukleové kyseliny. Môže tiež zafarbiť cytoplazmatické inklúzie vírusového pôvodu.

Aby sa hematoxylín zafarbil, musí byť v oxidovanom stave a viazaný na kov. Ten bude slúžiť na fixáciu k tkanivu, to znamená, že bude pôsobiť ako moridlo.

Keď sa hematoxylín oxiduje, nazýva sa hemateín. Oxidácia sa dosiahne vystavením pôsobeniu kyslíka (starnutiu) činidla alebo látok, ktoré pomáhajú jeho oxidácii (chemická oxidácia).

eozín

Eozín je farbivo, ktoré zafarbí červeno alebo ružovo. Je nerozpustný vo vode, aj keď existuje verzia rozpustná vo vode. Všeobecne sa eozín pripravuje rozpustením v alkohole (95 ° etanol).

Zafarbí cytoplazmy, svalové vlákna, cytoplazmatické organely a kolagén, ale nezafarbí jadrá buniek. Je to preto, že je negatívne nabitá, a preto má afinitu k pozitívne nabitým štruktúram.

Existujú dva typy eozínu „Y“ a „B“. Eozín „Y“ je známy ako žltý eozín. Jeho vedecký názov je tetrabrom fl uorescein a jeho chemický vzorec je C ₂₀ H ₈ Br ₄ O ₅ .

Na druhej strane sa eozín „B“ niekedy nazýva namodralý erytrozín B. Jeho vedecký názov je dibromodynitro fl uorescein a vzorec je C ₂₀ H ₈ Br ₂ N ₂ O ₉ . Obaja sú veľmi podobné a rozdiel medzi použitím jedného alebo druhého nie je v skutočnosti viditeľný. Najobľúbenejší je eozín „Y“.

Eozín má vlastnosť rozlišovať medzi živou bunkou a mŕtvou bunkou, pretože je schopná prechádzať cez membránu, aby zafarbila svoju cytoplazmu, keď sú bunky mŕtve, takže cytoplazma bunky zostane bezfarebná, ak zostane nažive.

aplikácia

Farbenie nervových vlákien

Hrubé nervové vlákna sa môžu zafarbiť a identifikovať pomocou hematoxylínu-eozínu. Nie je to však užitočné na farbenie tenkých nervových vlákien, pretože na ich vizualizáciu je potrebné farbenie striebrom.

Histologické škvrny na koži

Pri farbení nadržanej vrstvy kože je farbivom, ktoré pôsobí, eozín, pretože na tejto úrovni bunky nemajú jadro.

V granulovanej vrstve kože hematoxylín silno zafarbí granule keratohyalínu vo vnútri buniek granúl. Naopak, spinálna vrstva kože je slabo zafarbená hematoxylínom, zatiaľ čo bazálna alebo zárodočná vrstva je celkom zafarbená.

Eozín zafarbí cytoplazmu všetkých buniek a intenzita farby sa môže líšiť od vrstvy k vrstve.

Hematoxylíno-eozínové farbenie vzoriek stolice

Gómez a kol., V roku 2005 preukázali, že zafarbenie hematoxylínu-eozínu bolo pri identifikácii prípadov amébózy v dôsledku entamoeba histolytica a diskontinu entamoeba účinnejšie ako metóda čerstvej vizualizácie (fyziologický roztok a lugol) u pacientov s akútnym hnačkovým ochorením.

Ukázalo sa tiež, že je vysoko citlivý pri detekcii erytrofagocytózy (améby, ktoré pohltili erytrocyty).

Farbenie histologických rezov na diagnostiku infekcie

Walwyn a kol., V roku 2004 sa navrhlo použitie histologických škvŕn na detekciu mikroorganizmov spôsobujúcich infekciu.

Pomocou farbenia hematoxylínom-eozínom boli schopní vizualizovať infekcie spôsobené Clostridium, Actinomyces, spirillae alebo Candida. Tiež boli schopní pozorovať prítomnosť parazita Sarcoptes escabiei v kožných rezoch a vírusové inklúzie cytomegalovírusom a herpesom v rezoch rôznych tkanív.

techniky

Pre histologické vzorky

Zafarbenie histologického rezu prechádza radom krokov. Prvá vec je získať histologickú časť. Toto sa musí voskovať, aby sa neskôr získali rezy (ultrajemné) s mikrotómom. Táto technika pozostáva z nasledujúcich krokov:

1-Eliminácia prebytočného parafínu : na tento účel môžete použiť xylol alebo Heme-D ponorením na 3-5 minút.

2-Rehydratácia vzorky: dosiahne sa ponorením vzorky do rôznych koncentrácií alkoholov (etanol) v zostupnom poradí (100 °, 90 °, 70 °). Vo všetkých prípadoch 7 minút.

3-Eliminácia prebytočného alkoholu: na tento účel je ponorený do vody na 7 minút.

4-Farbenie hematoxylínom: vzorka sa ponorí na 6 - 10 minút do podnosu obsahujúceho hematoxylín. Doba expozície závisí od veľkosti a hrúbky vzorky.

5-Eliminácia prebytku hematoxylínu: 5 minút sa premyje vodou a potom sa kyslým alkoholom uskutoční rýchly prechod (10 až 20 sekúnd). Neskôr sa znova 5 minút premyje vodou. Potom sa ponorí do etanolu pri 96 ° C na 1 minútu.

6-sfarbenie eozínom: na tento účel sa vzorka ponorí na 5 minút do eozínovej misky.

7-Dehydratácia vzorky : za týmto účelom prechádza alkoholovými etážami (etanol), ale tentoraz vo vzostupnom poradí. (70 °, 90 °, 100 °). (Na 5 sekúnd, 5 sekúnd, 1 minúta).

8 - Vyčírenie vzorky : na tento účel sa vystaví pôsobeniu xylolu počas 5 až 10 minút a vysuší sa, aby natrvalo uzavrela balzam Kanady alebo iný podobný materiál.

Pre vzorky stolice, ktoré hľadajú

Na podložné sklíčko so stoličkou pre pacienta sa vytvorí náter a fixuje sa 80% alkoholom počas 5 minút. Doska sa ponorí do hematoxylínu počas 5 minút a okamžite sa premyje vodou.

Následne sa rýchlo ponorí do kyslého alkoholu a potom do amoniakovej vody. Premýva sa vodou. Zafarbí sa 5 minút v eozíne. Vzorka sa dehydratuje, ako je vysvetlené v doterajšom stave techniky, a nakoniec sa prepláchne xylénom.

Príprava reagencií

- hematoxylín

V jednom litri destilovanej vody rozpustite 50 gramov síranu hlinitého draselného alebo amónneho. Po úplnom rozpustení pridajte 1 gram kryštalizovaného hematoxylínu. Po úplnom rozpustení sa pridá 1 g kyseliny citrónovej spolu s 50 g hydrátu chloru a 0,2 g jodičnanu sodného.

Zmes sa varí počas 5 minút, potom sa nechá vychladnúť a prefiltruje sa, aby sa odstránili všetky tuhé častice, ktoré zostali. Takto pripravené činidlo sa môže použiť okamžite.

- Eozin

Môže sa pripraviť s alkoholovým základom alebo s vodnou bázou.

Alkoholický eozín

V 100 ml etanolu sa pri teplote 95 ° C rozpustí 0,5 gramu eozínu "Y". Potom pridajte niekoľko kvapiek ľadovej kyseliny octovej.

2% vodný eozín

V 1250 ml destilovanej vody sa rozpustí 25 gramov vo vode rozpustného eozínu „Y“. Potom pridajte niekoľko kvapiek ľadovej kyseliny octovej.

Kyslý alkohol

Odmerajte 0,5 ml koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej a doplňte na 100 ml absolútnym alkoholom.

Amoniaková voda

Odmerajte 0,5 ml koncentrovaného amoniaku a doplňte destilovanou vodou na 100 ml.

Referencie

1. Navarrete, G. Histológia kože. Rev Fac Med UNAM 2003; 46 (4): 130 - 133. K dispozícii na: medigraphic.com
2. Gómez-Rivera N, Molina A, García M, Castillo J, Castillo J, García R, Fonseca I, Valenzuela O.
3. Identifikácia Entamoeba histolytica / E. Dispar technikou čerstvého améby oproti jej vyfarbeniu hematoxylínom-eozínom pri akútnej hnačke. Rev Mex Pediatr 2005; 72 (3); 109-112. K dispozícii na: medigraphic.com
4. Walwyn V, Iglesias M, Almarales M, Acosta N, Mera A, Cabrejas M. Užitočnosť histologických techník na diagnostiku infekcie v anatomických vzorkách. Rev Cub Med Mil, 2004; 33 (2). K dispozícii na: scielo.sld
5. Reagencie spoločnosti PanReac AppliChem ITW. Farbenie hematoxylínom-eozínom. 2017, Španielsko. K dispozícii na adrese: itwreagents.com
6. Eozín. Wikipedia, slobodná encyklopédia. 7. november 2018, 08:18 UTC. 4. augusta 2019, 22:13 en.wikipedia.org
7. "Hematoxylin." Wikipedia, slobodná encyklopédia. 3. mája 2019, 11:23 UTC. 4. augusta 2019, 22:48 wikipedia.org