GRAMOVO FARBENIE: ODÔVODNENIE, MATERIÁLY, TECHNIKA A POUŽITIE - BIOLÓGIE - 2026

Gramovo farbenie je najjednoduchšie a najužitočnejší farbenie technika v diagnostickej mikrobiológie. Túto techniku ​​vytvoril dánsky lekár Hans Christian Gram v roku 1884, ktorý podľa zloženia bunkovej steny dokázal klasifikovať baktérie ako grampozitívne a gramnegatívne.

Táto technika prešla v roku 1921 určitými modifikáciami Huckera, aby sa stabilizovali činidlá a zlepšila sa kvalita zafarbenia, a preto je Gramovo farbenie známe aj ako Gram-Hucker.

Rôzne škvrny zafarbené Gramovým morením. A. Gram pozitívne koky. B. Gram negatívne tyče. C. Grampozitívne, polymorfonukleárne a mononukleárne bacily. D. Kvasinky.

S touto technikou je tiež možné pozorovať tvar mikroorganizmov, to znamená, ak sú okrem iného koky, bacily, kokobacily, pleomorfné, vláknité. Rovnako ako jeho distribúcia v priestore: v zhluku, v reťazci, izolovaná, vo dvojiciach, v tetradoch atď.

Ak existuje podozrenie na bakteriálnu infekciu, väčšina získaných vzoriek by sa mala na sklíčku rozotrieť a Gram zafarbiť na mikroskopické vyšetrenie.

Gramova správa povedie lekára o tom, aký typ mikroorganizmu môže byť príčinou infekcie, pred získaním konečného výsledku kultivácie.

V niektorých prípadoch je život pacienta veľmi kompromitovaný, preto lekári naliehavo potrebujú Gramovu správu na vykonanie empirickej liečby, zatiaľ čo čakajú na identifikáciu mikroorganizmu.

Napríklad, ak Gram odhalí, že v mozgovomiechovom moku existujú grampozitívne koky, lekár bude riadiť počiatočnú liečbu antibiotikami, ktoré eliminujú tento typ baktérií, podľa protokolov pre to stanovených.

Len čo konečný výsledok príde s názvom izolovaného mikroorganizmu a jeho príslušným antibiogramom, lekár zhodnotí, či má alebo nemá zmeniť terapiu. Toto rozhodnutie sa prijme na základe štúdie citlivosti mikroorganizmu na antibiotiká, ktoré prijíma, a vývoja pacienta.

základ

Je to technika, ktorá má 4 základné kroky: zafarbenie, fixácia moridlom, zmena farby a zafarbenie. Táto technika preto umožňuje okrem farbenia baktérií aj ich diferenciáciu.

Krištáľová violeť je prvé použité farbivo. Má afinitu k peptidoglykánu a zafarbí všetky prítomné baktérie purpurovo, potom sa umiestni lugol, ktorý pôsobí ako moridlo, to znamená, že indukuje tvorbu nerozpustných kryštálovo-fialových-jódových komplexov - ribonukleárnych proteínov v bunke. ,

Grampozitívne baktérie, ktoré majú hrubú stenu peptidoglykánu, tvoria viac komplexov (kryštalická fialová-jód), preto si zachovávajú farbu.

Okrem toho tiež ovplyvňuje, že stena grampozitívnych baktérií obsahuje väčšie množstvo nenasýtených kyselín, ktoré vykazujú veľkú afinitu k oxidačným činidlám (Lugol).

Medzitým majú gramnegatívne baktérie tenkú vrstvu peptidoglykánu, čo spôsobuje, že baktérie tvoria menej komplexov ako grampozitívne.

Potom nasleduje krok sfarbenia, kde sa grampozitívne a gramnegatívne baktérie správajú inak.

Gramnegatívne baktérie obsahujú vonkajšiu membránu bohatú na lipopolysacharidy, ktorá je súčasťou ich bunkovej steny. Tuky sa ničia kontaktom s acetónalkoholom, takže vonkajšia membrána sa destabilizuje a uvoľní sa fialový kryštál.

Týmto spôsobom sa potom vyrovná s safranínom alebo základným fuchsínom, ktorý zmení farbu na červenú.

V prípade grampozitívnych baktérií odolávajú vyblednutiu, pretože bielidlo funguje tak, že uzavrie póry, čo zabráni úniku kryštálovo-fialového / jódového komplexu.

Preto je sfarbenie kryštálovou violeťou stabilné a nie je tu žiadny priestor pre safranín alebo fuchsín. To je dôvod, prečo tieto baktérie zafarbujú tmavomodrú alebo fialovú farbu.

materiály

Gramova farbiaca súprava pozostáva z:

• Fialové sklo
• Lugolov
• Acetón alkohol
• Safranín alebo bázický fuchsín

Príprava farbív a činidiel

Krištáľovo-fialový roztok

Riešenie:

Fialový kryštál ------------- 2 gr

Etylalkohol 95% ----------- 20cc

Riešenie B:

Oxalát amónny ----------- 0,8 g

Destilovaná voda ------------- 80 cm3

Na konečnú prípravu kryštalickej fialovej musí byť roztok A zriedený 1:10 destilovanou vodou a zmiešaný so 4 dielmi roztoku B. Zmes sa pred použitím skladuje 24 hodín. Filtrujte do jantárovej zafarbenej fľaše pomocou filtračného papiera.

Množstvo, ktoré sa má použiť každý deň, sa prenesie do jantárovej kvapkacej fľaše.

Jód-Lugolov

Odvážte a zmerajte uvedené množstvo každej zlúčeniny takto:

Kryštály jódu ------------- 1gr

Jodid draselný ------------- 2gr

Destilovaná voda ------------- 300 cm3

Jodid draselný sa vo vode rozpustí postupne a potom sa pridá jód. Roztok sa holí do jantárovej fľaše.

Množstvo, ktoré sa má použiť každý deň, sa pomocou kvapkadla prenesie do menšej jantárovej fľaše.

bielenie

95% etylalkohol -----------– 50 ml

Acetón ------------------ 50 ml

Pripravuje sa v rovnakých častiach. Dobre prikryte, pretože má tendenciu sa odparovať.

Vložte do kvapkacej fľaše.

Tento prípravok poskytuje zmenu farby v miernom čase 5 - 10 sekúnd a je najviac odporúčaný.

Začiatočníci dávajú prednosť použitiu iba 95% etylalkoholu, pričom blednutie je pomalšie ako 10 až 30 sekúnd.

Zatiaľ čo skúsenejší môžu použiť čistý acetón, kde k sfarbeniu dochádza veľmi rýchlo od 1 do 5 sekúnd.

Contrast

Zásobný roztok safranínu

Safranina -------------– 2,5 g

Etylalkohol 95% --------– 100 cm3

Po zvážení uvedeného množstva safranínu sa rozpustí v 100 ml 95% etylalkoholu.

Pracovný roztok safranínu sa pripravuje zo zásobného roztoku.

Za týmto účelom odmerajte 10 ml zásobného roztoku, pridajte 90 ml destilovanej vody, aby sa vytvorilo 100 ml.

Odporúča sa preniesť množstvo, ktoré sa má denne používať, do jantárovej fľaše s kvapkadlom.

Mikroorganizmy, ktoré slabo sfarbujú Gram-negatívne s Gram-Huckerovým farbením, ako sú určité anaeróby, Legionella sp, Campylobacter sp. A Brucella sp, sa môžu zafarbiť oveľa lepšie pomocou Kopeloffovej modifikácie Gram-Huckerovej farbenia, nazýva sa Gram-Kopeloffova škvrna.

Táto technika mení farbivo safranínu na zásaditý fuchsín. Touto modifikáciou je možné efektívne zafarbiť vyššie uvedené mikroorganizmy.

Uchovávanie reagencií

Pripravené farbivá sa musia uchovávať pri izbovej teplote.

Príprava náteru vzorky, ktorá sa má zafarbiť

Vzorka musí obsahovať aspoň 10 ⁵ mikroorganizmov pred pozorovaním mikroorganizmu v náteru je pravdepodobné. Šmuhy môžu byť vyrobené z priamej vzorky alebo z kultúr v pevnom alebo tekutom médiu.

Nátery by mali byť jednotné, dobre rozmiestnené a nie príliš silné, aby sa zlepšila vizualizácia prítomných štruktúr.

-Gram priamych vzoriek

Gram z nekoncentrovaného moču

Moč sa zmieša a na sklíčko sa umiestni 10 ul. Pozorovanie aspoň jednej baktérie / dip poľa naznačuje, že existuje infekcia.

Znamená to, že sa kultúra bude mať približne viac ako 100.000 CFU / ml (10 ⁵ CFU / ml) moču v 85% prípadov.

Táto metóda nie je užitočná pre počty kolónií pod 100 000 CFU.

CSF Gram

CSF by sa mal odstrediť, supernatant odstrániť a peleta sa natrela na podložné sklíčko. Táto kvapalina je za normálnych podmienok sterilná; pozorovanie baktérií naznačuje infekciu.

Gram z dýchacích vzoriek

Gram spúta, bronchiálna alebo bronchoalveolárna výplach, aj keď môže existovať celý rad mikroorganizmov, bude vždy viesť k diagnostike, okrem toho, že bude užitočný typ pozorovaných buniek.

V prípade spúta by sa mal náter pripraviť s najnepulentnejšou časťou vzorky.

Gramová stolica

U tohto typu vzoriek sa neodporúča vykonávať Gram, pretože nemá diagnostickú hodnotu.

-Gram plodín

Môžu sa uskutočňovať dvoma spôsobmi, jeden z kvapalných kultúr a druhý z pevných kultúr.

Kvapalné kultúry

Z tekutých kultúr je to veľmi jednoduché; Pod horák sa vyberie niekoľko pečienok zakaleného vývaru a umiestni sa na čisté a suché podložné sklíčko, ktoré robí krúživými pohybmi od stredu smerom k okraju, aby sa materiál rovnomerne rozložil.

Nechajte ho na vzduchu spontánne zaschnúť. Po vysušení sa materiál pripevní k fólii teplom. Aby sa to dosiahlo pomocou pinzety, list prešiel plameňom Bunsenovho horáka 3 až 4 krát, pričom dávajte pozor, aby nedošlo k spáleniu materiálu.

Doska sa nechá vychladnúť a umiestni sa na farbiaci mostík.

Pevné plodiny

Na vykonanie náteru podľa Gramovho zafarbenia z tuhej kultúry postupujte takto:

Pred výberom kolónií, ktoré sa majú odobrať, by sa malo pripraviť podložné sklíčko s umiestnením približne dvoch kvapiek sterilného fyziologického roztoku.

Ak pôvodná kultivačná platňa obsahuje niekoľko rôznych druhov kolónií, vyberie sa izolovaná kolónia každej kolónie na vykonanie gramu. Každá kolónia sa odoberie s platinovou slučkou, aby sa rozpustila v soľnom roztoku predtým umiestnenom na podložné sklíčko.

Kruhové pohyby sa vykonávajú od stredu smerom k periférii, aby sa kolónia rovnomerne rozdelila na sklíčko.

Nechajte ho na vzduchu spontánne zaschnúť. Po zaschnutí sa fólia fixuje teplom, ako je vysvetlené vyššie (pomocou horáka na horáku), dávajte pozor, aby ste materiál nespálili.

Tento postup sa musí vykonať s každým iným typom kolónie. Na kus papiera by sa malo uviesť poradie toho, čo sa pozoruje, napríklad:

Kolónia 1: Beta-hemolytická žltá kolónia: V zhlukoch boli pozorované grampozitívne koky

Kolónia 2: Krémovo sfarbené kolónie bez hemolýzy: Boli pozorované gramnegatívne kokobacily.

Každá snímka musí byť označená, aby sme vedeli, čo pozorujeme.

technika

Technika farbenia podľa Grama je extrémne ľahká na vykonanie a je relatívne lacná a v mikrobiologickom laboratóriu sa nemôže vynechať.

Robí sa takto:

1. Natrite náter a umiestnite na farbiaci mostík.
2. Sklíčko úplne zakryte kryštálovou fialovou na 1 minútu.
3. Opláchnite vodou Nesušte
4. Fóliu zakryte roztokom na batožinu, nechajte pôsobiť 1 minútu. Opláchnite vodou Nesušte.
5. Bielenie po dobu 5-10 sekúnd za jemného trepania v alkohole acetóne. Alebo položte hárok do zvislej polohy a kvapky odfarbovača kvapajte na povrch, až kým sa neodstráni prebytočné nezafarbené fialové sklo. Neprekračujte.
6. Opláchnite vodou Nesušte.
7. Nasaďte podložné sklíčko na farbiaci mostík a prikryte ho 30 sekúnd safranínom (Gram-Hucker) alebo 1 minútu základným fuchsínom (Gram-Kopeloff).
8. Umyte vodou
9. Nechajte ho na sucho na vzduchu vo zvislej polohe.

Po zaschnutí umiestnite 1 kvapku imerzného oleja do svetelného mikroskopu pod objektív 100X.

užitočnosť

Táto technika umožňuje rozlíšiť morfotintoriálne rozdiely väčšiny baktérií.

Kvasinky sa tiež vyznačujú týmto sfarbením. Krištáľovú fialovú berú, to znamená, že zafarbia Gram pozitívne.

Na druhej strane je možné rozlíšiť grampozitívne bacily tvoriace spóry, v ktorých je v bacille pozorovaný voľný priestor, kde sa vytvoril endospor, hoci spóry sa nezafarbili dobre. Na farbenie spór sa používajú ďalšie techniky, ako napríklad Shaeffer-Fulton.

Je potrebné poznamenať, že toto zafarbenie sa nepoužíva na farbenie všetkých typov baktérií, to znamená, že existujú prípady, keď zafarbenie nefunguje.

V tomto prípade je možné uviesť baktérie bez bunkovej steny. Napríklad: rod Mycoplasma, sfheroplasty, ureaplazma, L-formy a protoplasty.

Veľmi zle tiež zafarbí baktérie stenami bohatými na kyseliny mykolové, ako napríklad Mycobacteria, a vnútrobunkové baktérie, ako sú Chlamydias a Rickettsias.

Je tiež neúčinná pri farbení väčšiny spirochetálnych baktérií.

Existujú baktérie rovnakého rodu, ktoré možno pozorovať v tej istej vzorke ako grampozitívne a gramnegatívne. Keď sa to stane, nazýva sa to variabilné Gramovo farbenie, ktoré môže byť spôsobené zmenou živín, teploty, pH alebo koncentrácie elektrolytu.

Bežné chyby

Nadmerné bielenie

Zveličovanie v kroku sfarbenia môže viesť k pozorovaniu falošných gramnegatívnych mikroorganizmov.

Nečakajte dosť dlho na to, aby ste pridali ponorný olej

Môže spôsobiť grampozitívne baktérie, aby zafarbili gramnegatívne (falošne gramnegatívne). Deje sa tak preto, že v starých kultúrach sú pravdepodobne mŕtve alebo rozmaznané baktérie a za týchto podmienok si baktérie neudržiavajú kryštalickú fialovú.

Používajte veľmi starý roztok batol:

V priebehu času stratí háčik svoje vlastnosti a jeho farba zmizne. Ak sa použije už degenerované činidlo, nebude kryštál dobre fixovať, preto existuje možnosť získať vizualizáciu falošne gramnegatívnych mikroorganizmov.

Modré pozadie

Správne sfarbené pozadie bude červené. Modré pozadie naznačuje, že sfarbenie bolo nedostatočné.

Referencie

1. Ryan KJ, Ray C. 2010. Sherris. Medical Microbiology, 6. vydanie McGraw-Hill, New York, USA
2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. (5. vydanie). Argentina, Editorial Panamericana SA
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Argentína. Editorial Panamericana SA
4. Casas-Rincón G. 1994. General Mycology. 2. vydanie, Centrálna univerzita Venezuela, vydanie knižníc. Venezuela Caracas.
5. "Gramové škvrny." Wikipedia, slobodná encyklopédia. 4. októbra 2018, 23:40 UTC. 9. decembra 2018, 17:11. Prevzaté zo stránky es.wikipedia.org.
6. González M, González N. 2011. Manuál lekárskej mikrobiológie. 2. vydanie, Venezuela: Riaditeľstvo médií a publikácií University of Carabobo.
7. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Základné škvrny v mikrobiologickom laboratóriu. Výskum zdravotného postihnutia. 2014; 3 (1): 10-18.