GIEMSA FARBENIE: ZDÔVODNENIE, MATERIÁLY, TECHNIKA A POUŽITIE - BIOLÓGIE - 2026

Giemsa škvrna je typ farbenie klinických vzoriek, vztiahnuté na zmes kyslých a zásaditých farbív. Jeho tvorba sa inšpirovala prácou Romanowského, kde ju Gustav Giemsa, chemik a bakteriológ pôvodom z Nemecka, zdokonalil pridaním glycerolu na stabilizáciu zlúčenín.

Zmeny generované pôvodnou Romanowskou technikou umožnili značne zlepšiť mikroskopické pozorovania, preto bola táto technika pokrstená menom Giemsa farbenie.

Rôzne vzorky zafarbené Giemsovým farbením. A. Trypanosoma evansi v periférnej krvi. B. Normálne krvinky. C. Borrelia theileri v periférnej krvi. D. Burkittov lymfóm.

Pretože je to jednoduchá technika, ktorá je vysoko funkčná a ekonomická, v súčasnosti sa v klinickom laboratóriu bežne používa na hematologické nátery, vzorky kostnej drene a rezy tkanív.

Technika farbenia Giemsa je veľmi užitočná pre cytologické štúdie, pretože umožňuje pozorovanie špecifických bunkových štruktúr. Táto technika zafarbí cytoplazmy, jadrá, jadrá, vakuoly a granuly buniek, pričom je schopná rozlíšiť aj jemné stopy chromatínu.

Ďalej je možné detegovať významné zmeny vo veľkosti, tvare alebo sfarbení jadra, kde je možné vizualizovať stratu vzťahu medzi jadrom a cytoplazmou.

Na druhej strane umožňuje identifikovať nezrelé bunky v kostnej dreni a periférnej krvi, čo je dôležité pre diagnostiku závažných chorôb, ako je leukémia. Je tiež možné detegovať okrem iného hemoparazity, extra a intracelulárne baktérie, huby.

V cytogenetike je široko používaný, pretože je možné študovať mitózu buniek.

Základ zafarbenia Giemsa

Farbivá typu Romanowsky sú založené na použití kontrastu medzi kyslými a zásaditými farbivami, aby sa dosiahlo zafarbenie bázickej a kyslej štruktúry. Ako je možné vidieť, existuje afinita kyslých farbív k zafarbeniu bázických štruktúr a naopak.

Ako základné farbivo sa používa metylénová modrá a jej oxidované deriváty (Azure A a Azure B), zatiaľ čo kyslé farbivo je eozín.

Kyslé štruktúry buniek sú nukleové kyseliny, granule segmentovaných bazofilov, medzi inými aj preto budú zafarbené metylénovou modrou.

V tomto istom zmysle sú základné štruktúry buniek hemoglobín a niektoré granule, ako sú napríklad granule obsiahnuté v segmentovaných eozinofiloch; tieto budú zafarbené eozínom.

Na druhej strane, vzhľadom na to, že metylénová modrá a azúrová farba sa vyznačujú tým, že sú metachromatickými farbivami, môžu poskytovať rôznym štruktúram rôzny odtieň podľa zaťaženia polyaniónov, ktoré majú.

Takto sa strategickej kombinácii základných a kyslých farbív podarí vyvinúť široké spektrum farieb podľa biochemických charakteristík každej štruktúry, prechádzajúcich cez svetlo modrú, tmavomodrú, fialovú a fialovú farbu v prípade kyslých štruktúr.

Zatiaľ čo sfarbenie poskytované eozínom je stabilnejšie, vytvára farby medzi červenkastooranžovým a lososom.

materiály

Materiály na prípravu zásobného roztoku

Príprava zásobného roztoku vyžaduje naváženie 600 mg práškového farbiva Giemsa, meranie 500 ml metylalkoholu bez acetónu a 50 ml neutrálneho glycerínu.

Ako pripraviť zásobný roztok

Ťažký prášok Giemsa vložte do malty. Ak existujú hrče, mali by sa postriekať. Následne pridajte značné množstvo odmeraného glycerínu a dobre premiešajte. Získaná zmes sa naleje do veľmi čistej jantárovej fľaše.

Zvyšok glycerínu sa umiestni do malty. Zmiešajte znova, aby ste vyčistili zvyšok farbiva, ktoré sa prilepilo na steny malty a pridajte do rovnakej nádoby.

Fľaša sa uzavrie a umiestni na 2 hodiny do vodného kúpeľa pri 55 ° C. Keď je vo vodnom kúpeli, jemne pretrepávajte zmes každú pol hodinu.

Následne sa zmes nechá vychladnúť, aby sa umiestnil alkohol. Predtým sa časť odmeraného alkoholu vloží do malty, aby sa dokončilo umývanie zostávajúceho farbiva, a potom sa pridá k zmesi spolu so zvyškom alkoholu.

Tento prípravok by sa mal nechať zrieť najmenej 2 týždne. Použitá časť zásobného roztoku by mala byť filtrovaná.

Aby sa zabránilo kontaminácii prípravku, odporúča sa preniesť časť, ktorá sa bude nepretržite používať, do malej jantárovej fľaše s kvapkadlom. Doplňte vždy, keď dôjde vyčerpanie činidla.

Materiály na prípravu tlmivého roztoku

Na druhej strane sa tlmivý roztok s pH 7,2 pripravuje nasledujúcim spôsobom:

6,77 g fosforečnanu sodného (bezvodého) (NaHPO ₄ ), 2,59 g dihydrogénfosforečnanu draselného (KH ₂ PO ₄ ) a destilovanej vody sa naváži do 1000 ccm.

Konečná príprava farbiva

Na prípravu konečného farbiaceho roztoku sa odmerajú 2 ml prefiltrovaného zásobného roztoku a zmiešajú sa so 6 ml tlmivého roztoku. Zmes sa mieša.

Relevantnou skutočnosťou, ktorú je potrebné zohľadniť, je skutočnosť, že techniky farbenia sa môžu meniť v závislosti od obchodnej spoločnosti.

Na vykonanie vyfarbenia sú potrebné ďalšie materiály

Okrem opísaných materiálov musíte mať k dispozícii aj premývacie mostíky, tričká s vodou alebo tlmivým roztokom na pranie, diapozitívy alebo poťahy na predmety, stopky na kontrolu doby sfarbenia a pijavý papier alebo nejaký materiál, ktorý sa dá použiť na sušenie ( gáza alebo bavlna).

technika

Proces farbenia

1) Pred farbením musí byť náter vzorky pripravený na čistom podložnom sklíčku.

Vzorky môžu byť vzorky krvi, kostnej drene, histologických tkanivových rezov alebo krčka-vaginálnych vzoriek. Pred sfarbením sa odporúča, aby nátierky boli tenké a mali 1 alebo 2 hodiny sušenia.

2) Na farbiaci mostík umiestnite všetky listy, ktoré majú byť farbené. Vždy pracujete v rovnakom poradí a každý hárok je dobre identifikovaný.

3) Na náter naneste niekoľko kvapiek 100% metylalkoholu (metanol) a nechajte pôsobiť 3 až 5 minút, aby sa vzorka fixovala a dehydratovala.

4) Zlikvidujte metanol prítomný na fólii a nechajte uschnúť na vzduchu.

5) Po uschnutí vložte konečný roztok na farbenie kvapkadlom, kým sa celá fólia nezakryje. Nechajte pôsobiť 15 minút. Niektorí autori odporúčajú do 25 min. Závisí to od obchodného domu.

6) Zanechajte škvrnu a škvrnu umyte destilovanou vodou alebo 7,2 tlmivým roztokom.

7) Na savý papier nechajte listy vyschnúť na čerstvom vzduchu, zvislo usporiadané pomocou podpery.

8) Očistite zadnú časť sklíčka alkoholovým tampónom alebo vatovým tampónom, aby ste odstránili všetky stopy.

utilities

Technika farbenia Giemsa sa používa v rôznych oblastiach vrátane hematológie, mykológie, bakteriológie, parazitológie, cytologie a cytogenetiky.

hematológie

Je to najčastejšie použitie tohto škvrny. S ním je možné identifikovať každú bunku prítomnú vo vzorkách kostnej drene alebo periférnej krvi. Rovnako ako odhad počtu každej série, schopnosť detegovať leukocytózu alebo leukopéniu, trombocytopéniu atď.

Pretože je citlivý na identifikáciu nezrelých buniek, je dôležitý pri diagnostike akútnych alebo chronických leukémií. Je tiež možné stanoviť diagnózu anémie, ako je kosáčikovitá anémia, kosáčikovitá bunka a iné.

mykológia

V tejto oblasti je jeho použitie bežné pri hľadaní Histoplasma capsulatum (intracelulárna dimorfná huba) vo vzorkách tkanív.

bakteriológie

V hematologických náteroch zafarbených Giemsou je možné detegovať Borrelias sp u pacientov s ochorením zvaným opakujúca sa horúčka. Spirochéty sú hojné medzi erytrocytmi vo vzorkách odobratých na vrchole horúčky.

V infikovaných bunkách je tiež možné vizualizovať intracelulárne baktérie, ako napríklad Rickettsia sp a Chlamydia trachomatis.

parazitológia

V oblasti parazitológie umožňuje farbenie Giemsa diagnostikovať parazitárne choroby, ako je malária, Chagasova choroba a leishmanióza.

V prvých dvoch, parazitoch Plasmodium sp a Trypanosoma cruzi je možné pozorovať periférnu krv infikovaných pacientov, možno ich nájsť v rôznych štádiách v závislosti od štádia ochorenia.

Na zlepšenie hľadania parazitov v krvi sa odporúča použiť farbenie Giemsa zmiešané s farbením May-Grünwald.

Podobne je možné diagnostikovať kožnú leishmaniózu vyhodnotením vzoriek biopsie kože zafarbenej Giemsou, kde sa nachádza parazit.

cytológia

Farbenie Giemsou sa tiež používa na cytologické štúdium endocervikálnych vzoriek, hoci na tento účel to nie je najčastejšie používaná technika.

Ale v prípade nedostatku zdrojov sa môže použiť, má podobnú funkčnosť ako tá, ktorú ponúka technika Papanicolaou a má nižšie náklady. Vyžaduje si to však odborné znalosti skúšajúceho.

cytogenetika

Dôležitou črtou farbenia Giemsou je jej schopnosť silne sa viazať na oblasti DNA bohaté na adenín a tymín. To umožňuje vizualizáciu DNA počas bunkovej mitózy v rôznych stavoch kondenzácie.

Tieto štúdie sú potrebné na zistenie chromatických aberácií, ako sú duplikácie, delécie alebo translokácie rôznych oblastí chromozómov.

Výskum demonštrujúci účinnosť farbenia Giemsa

Cannova a kol. (2016) porovnali 3 farbiace techniky na diagnostiku kožnej leishmaniózy.

Na tento účel použili vzorky získané z pokusného zvieraťa (Mesocrisetus auratus) experimentálne naočkovaného Leishmanias.

Autori preukázali, že farbenie Giemsa bolo lepšie ako farbenie Pap-mart® a Gaffney. Preto považovali farbenie Giemsa za ideálne na diagnostiku kožnej leishmaniózy.

Vynikajúce výsledky, ktoré autori dosiahli, sú dané skutočnosťou, že kombinácia farbív, ktoré tvoria zmes Giemsa, predstavuje nevyhnutné podmienky na vytvorenie priaznivého kontrastu, čo umožňuje jasné rozlíšenie štruktúr amastigotov, a to tak intracelulárne, ako aj extracelulárne.

Urobili to aj iné techniky (Pap-mart® a Gaffney), ale slabším spôsobom, a preto je ich vizualizácia zložitejšia. Preto sa farbenie Giemsa odporúča na parazitologickú diagnostiku leishmaniózy.

Podobne štúdia Ramírez et al (1994) hodnotila platnosť Giemsa a Lendrum škvŕn v spojivkových náteroch na identifikáciu Chlamydia trachomatis.

Autori stanovili, že škvrny Giemsa a Ledrum majú rovnakú špecifickosť, ale zistilo sa, že Giemsa je citlivejšia.

Toto vysvetľuje, prečo sa farbenie Giemsa v súčasnosti najčastejšie používa na diagnostiku chlamýdiových infekcií, najmä ak je k dispozícii málo zdrojov.

Zdroj: Reagencie ITR spoločnosti PanReac Applichem. Giemsa škvrna. Verzia 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Španielsko.

Odporúčania pre dobré zafarbenie

Sušenie dosiek by sa nemalo urýchliť. Očakáva sa, že sa musí vyschnúť na čerstvom vzduchu v primeranom čase. Približne 2 hodiny.

Ak chcete dosiahnuť najlepšie výsledky, zafarbte ihneď po 2 hodinách.

Aby sa náter mohol lepšie zafixovať a zafarbiť, musí sa vzorka na sklíčku rozdeliť tak, aby zostala tenká a rovnomerná vrstva.

Výhodná vzorka krvi je kapilárna, pretože náter je vyrobený priamo z kvapky krvi, a preto vzorka neobsahuje žiadne prísady, ktoré uprednostňujú udržiavanie bunkových štruktúr.

Ak sa však používa žilová krv, EDTA by sa mala používať ako antikoagulancia a nie heparín, pretože heparín obvykle bunky deformuje.

Časté chyby pri farbení Giemsou

Pri praktizovaní tohto sfarbenia sa môžu vyskytnúť chyby. Dokazujú to náhle zmeny v tonalitách štruktúr.

Mimoriadne modré sfarbenie

Môže to byť spôsobené:

• Veľmi silné nátery
• Prekročenie času farbenia
• Neumývajte sa dostatočne.
• Použitie činidiel vysoko nad neutrálnym (zásaditým) pH.

Za týchto podmienok sú farby nasledujúcich štruktúr skreslené tak, že erytrocyty namiesto zafarbenia lososovo ružovej sa objavia zelené, granule eozinofilov, ktoré musia byť zafarbené tehlovočervené, zmenia farbu na modrastú alebo sivú a tak ďalej. odchýlka v obvyklých tónoch.

Nadmerne ružové sfarbenie

Môže to byť spôsobené:

• Nedostatočný čas na farbenie.
• Predĺžené alebo nadmerné pranie.
• Zlé sušenie.
• Použitie vysoko kyslých reagencií.

V tomto konkrétnom prípade nebudú štruktúry, ktoré normálne sfarbujú modrú farbu, takmer viditeľné, zatiaľ čo štruktúry, ktoré sfarbujú ružovú farbu, budú mať výrazne prehnané odtiene.

Príklad: Červené krvinky zmenia jasne červenú alebo jasne oranžovú farbu, jadrový chromatín sa javí ako bledoružový a eozinofilné granule zafarbia tmavočervenú farbu.

Prítomnosť zrazenín v nátere

Príčiny môžu byť:

• Používajte špinavé alebo zle umyté filmy.
• Nenechajte náter dobre zaschnúť.
• Ponechajte fixačný roztok príliš dlho.
• Na konci zafarbenia neprimerané pranie.
• Nedostatočná filtrácia alebo žiadna filtrácia použitého farbiva.

Prítomnosť morfologických artefaktov

Morfologické artefakty sa môžu objaviť v náteroch, čo sťažuje vizualizáciu a interpretáciu prítomných štruktúr. Dôvodom je:

• Typ použitého antikoagulantu, napríklad heparín.
• Použitie špinavých, poškodených alebo mastných filmov.

Režim ukladania

Po príprave sa musí farbivo uchovávať pri izbovej teplote (15 - 25 ° C), aby sa zabránilo vyzrážaniu farbiva. Mal by sa skladovať v tesne uzatvorenej jantárovej nádobe.

Referencie

1. Cannova D, Brito E a Simons M. Hodnotenie techník farbenia na diagnostiku kožnej leishmaniózy. Salus. 2016; 20 (2): 24 - 29.
2. Reagencie ITR spoločnosti PanReac Applichem. Giemsa škvrna. Verzia 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Španielsko.
3. Clark G. Farbiace postupy (1981), 4. vydanie. Williams & Willkins.
4. Aplikovaná klinická chémia. Giemsa farbenie pre diagnostiku in vitro. Distribútor: cromakit.es
5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F a Grazioso C. Platnosť škvŕn Giemsa a Lendrum v spojivkových náteroch na identifikáciu Chlamydia trachomatis. Bol Sanit Panam. 1994; 116 (3): 212 - 216.
6. Casas-Rincón G. Všeobecná mykológia. 1994. 2. vydanie, Central University of Venezuela, Edícia knižníc. Venezuela Caracas.
7. "Giemsa škvrna." Wikipedia, slobodná encyklopédia. 1. sep 2017, 01:02 UTC. 6. decembra 2018, es.wikipedia.org.