FARBENIE SPÓR: ODÔVODNENIE, TECHNIKY A POUŽITIA - BIOLÓGIE - 2026

Farbenie spór je metóda použitá k zmene farby na odolnosť voči štruktúry, ktoré tvoria určitý bakteriálne rody, keď v nepriaznivých podmienkach; Tieto štruktúry zodpovedajú forme prežitia.

Existuje mnoho rodov, ktoré tvoria spory; hlavnými sú však Bacillus a Clostridium. Tieto rody sa považujú za relevantnejšie, pretože majú pre človeka patogénne druhy.

Farbenie spór metódou Shaeffer - Fulton alebo Wirtz-Conklin. A tambe (pôvodný uploader) z Wikimedia Commons

Každý bacil môže viesť k sporom. V čase zafarbenia prípravku sa spór nachádza vo vnútri bacilu (endospore) alebo mimo neho (exospore). Pri konvenčných technikách farbenia baktérií - ako je Gramovo farbenie - zostávajú spóry bezfarebné.

V súčasnej dobe existuje niekoľko metodológií farbenia, ktoré sú schopné preniknúť do hrubej štruktúry spór a farbiť ju. Tieto metodiky sú veľmi rozmanité; Patria sem Dornerova technika, Möellerova škvrna a metodológia Shaeffera - Fultona, známa tiež ako Wirtz-Conklin.

Zo všetkých uvedených techník je metodika Shaeffer-Fulton najbežnejšie používaná v bežných laboratóriách. Je pomenovaný po dvoch mikrobiológoch, ktorí vytvorili sfarbenie v roku 1930: Alicia Shaeffer a MacDonald Fulton. Táto technika sa však niekedy nazýva Wirtz-Conklin po dvoch bakteriológoch z 20. rokov 20. storočia.

základ

Spóry sa nezafarbia konvenčnými škvrnami, pretože majú veľmi hrubú stenu. Komplexné zloženie spór bráni vstupu väčšiny farbív.

Ak sa spór skúma zvonka dovnútra, pozorujú sa nasledujúce vrstvy: najprv je exosporium, ktoré je najtenšou a vonkajšou vrstvou tvorenou glykoproteínmi.

Ďalej prichádza kutikula, ktorá poskytuje odolnosť voči vysokým teplotám, nasledovaná kortexom zloženým z peptidoglykánu. Neskôr je stena základne, ktorá chráni protoplast.

Spór je dehydratovaná štruktúra, ktorá obsahuje 15% vápnika a kyseliny dipikolínovej. Preto väčšina techník farbenia spór spočíva v aplikácii tepla, takže farbivo môže preniknúť cez hrubú štruktúru.

Po zafarbení spór nemôže farbivo odstrániť. Pri technike Shaeffer - Fulton vstupuje malachitová zeleň do vegetatívnych buniek a pri pôsobení tepla preniká endosporou aj exosporami.

Premytím vodou sa farbivo odstráni z vegetatívnej bunky. K tomu dochádza, pretože malachitové zelené farbivo je mierne zásadité, takže sa slabo viaže na vegetatívnu bunku.

Namiesto toho sa nemôže dostať von zo spór a nakoniec je bacil kontrastne vyfarbený safranínom. Tento základ platí pre zvyšok techník, v ktorých sa niečo podobné deje.

Techniky farbenia spór

Na vykonanie farbenia spór sa musí získať čistá kultúra podozrivého kmeňa, ktorý sa má študovať.

Kultúra sa vystaví extrémnym teplotám počas 24 hodín, aby stimulovala mikroorganizmy k sporulácii. Za týmto účelom sa kultúra môže umiestniť do sušiarne pri 44 ° C alebo do chladničky (8 ° C) na 24 alebo 48 hodín.

Ak sa pri uvedených teplotách ponechá príliš dlho, budú pozorované iba exospory, pretože všetky endospory už opustili bacil.

Na konci času sa niekoľko kvapiek sterilného fyziologického roztoku vloží na čisté podložné sklíčko. Potom sa odoberie malá časť kultúry a vytvorí sa jemná nátierka.

Potom sa nechá uschnúť, zafixuje sa v teple a zafarbí sa jednou z techník vysvetlených nižšie:

Dornerova technika

1 - Pripravte do skúmavky koncentrovanú suspenziu sporulovaného mikroorganizmu v destilovanej vode a pridajte rovnaký objem prefiltrovaného fuchsínu karbolu Kinyoun.

2 - Vložte skúmavku do kúpeľa s vriacou vodou na dobu 5 až 10 minút.

3 - Na čistom podložnom sklíčku zmiešajte kvapku predchádzajúcej suspenzie s kvapkou 10% vodného roztoku nigrozínu, prevarte a prefiltrujte.

4. Rozotrite a rýchlo usušte jemným teplom.

5. Skúmajte pomocou objektívu 100X (ponorenie).

Spóry sfarbujú červenú farbu a bakteriálne bunky sa javia takmer bezfarebne na tmavosivom pozadí.

Modifikovaná Dornerova technika

1 - Suspenzia sporulovaného mikroorganizmu sa rozprestiera na sklíčku a fixuje sa v horúcom prostredí.

2 - Vzorka sa prikryje prúžkom filtračného papiera, do ktorého sa pridá karbol fuchsín. Farbivo sa zahrieva 5 až 7 minút plameňom Bunsenova horáka, až kým sa nevytvorí vývoj pár. Potom sa papier vyberie.

3 - Prípravok sa premyje vodou a potom sa vysuší pomocou absorpčného papiera.

4 - Náter zakryte tenkým filmom 10% nigrosínu, pomocou druhého sklíčka naneste na nigrosín alebo ihlu.

Sfarbenie spór a baktérií je rovnaké ako v doterajšom stave techniky.

Shaeffer - technika Fulton alebo Wirtz-Conklin

1 - Na podložné sklíčko urobte jemný náter so suspenziou napadnutého mikroorganizmu a fixujte ho zahrievaním.

2 Sklíčko prikryte 5% vodným roztokom malachitu (na sklíčko môžete položiť filtračný papier).

3 - zahrievajte plameň Bunsenového horáka, aby sa uvoľnili výpary, a plameň odstráňte. Opakujte operáciu 6 až 10 minút. Ak sa malachitový zelený roztok počas postupu príliš odparí, je možné pridať viac.

4. Vyberte filtračný papier (ak je nainštalovaný) a umyte ho vodou.

5 - Sklíčko prikryte 0,5% vodným safranínom po dobu 30 sekúnd (niektoré varianty techniky používajú 0,1% vodný safranín a nechajte ho 3 minúty).

Pri tejto technike sa spóry javia ako zelené a bacily červené.

Nevýhodou je, že endospory mladých kultúr sa nezafarbujú dobre, pretože sa javia ako veľmi číre alebo bezfarebné. Aby sa tomu zabránilo, odporúča sa používať kultúry so 48-hodinovou inkubáciou.

Möellerova technika

1 - Náter zakryte chloroformom na 2 minúty.

2. Zlikvidujte chloroform.

3. Zakryte 5% kyselinou chrómovou po dobu 5 minút.

4. Opláchnite destilovanou vodou

5- Doska je potiahnutá karbolom fuchsín-fenicada a je vystavená plameňu Bunsenovho horáka až do emisie pár; potom je na chvíľu odstránený z plameňa. Operácia sa opakuje do ukončenia 10 minút.

6. Opláchnite vodou.

7. Na zmenu farby použite okyslený etanol (chlorovodíkový alkohol). Ponechá sa 20 alebo 30 sekúnd.

8. Opláchnite destilovanou vodou.

9 - Kontrastný materiál potiahnite vrstvou metylénovou modrou po dobu 5 minút.

10- Opláchnite destilovanou vodou.

11- Nechajte uschnúť a vzorka sa odoberie do mikroskopu.

Spóry sú červené a bacily modré. Je dôležité nevdychovať výpary, pretože sú jedovaté a z dlhodobého hľadiska môžu byť karcinogénne.

Modifikovaná Möellerova technika bez tepla

V roku 2007 Hayama a jeho spolupracovníci vytvorili modifikáciu Möellerovej techniky. Odstránili krok zahrievania farbiva a nahradili ho pridaním 2 kvapiek povrchovo aktívnej látky Tergitol 7 na každých 10 ml roztoku fuchsín-karbol karbolu. Získali sa rovnaké výsledky.

aplikácia

Zafarbenie spór poskytuje veľmi cenné a užitočné informácie na identifikáciu patogénu, pretože jeho prítomnosť, jeho tvar, umiestnenie v bacile a schopnosť deformovať vegetatívnu bunku alebo nie sú údaje, ktoré môžu druh viesť. zapojené do určitého žánru.

V tejto súvislosti je potrebné uviesť, že spóry môžu byť guľaté alebo oválne, môžu byť umiestnené v strede alebo tiež v paracentrálnej, subminálnej alebo koncovej polohe.

Schéma tvaru a polohy endospor a exospor

Príklady

- Clostridium difficile vytvára oválnu spóru v koncovej polohe, ktorá deformuje bacil.

- Spór klostrídium terium je oválny, nedeformuje bacil a je umiestnený na úrovni terminálu.

- Endopora Clostridium tetani je terminálna a deformuje bacil, čo vytvára vzhľad paličky.

- Spóry Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. novy a C. septicum sú okrúhle alebo subterminálne oválne a deformujú bacil.

- Endopora Clostridium sordelli sa nachádza v strednej polohe s miernou deformáciou.

Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. (5. vydanie). Argentina, Editorial Panamericana SA

Referencie

1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Návrh zjednodušenej techniky na farbenie bakteriálnych spór bez pôsobenia tepla - úspešná modifikácia Moellerovej metódy. Eur J Med Res. 2007; 16 12 (8): 356-9.
2. Prispievatelia Wikipedia. Moellerova škvrna. Wikipedia, slobodná encyklopédia. 3. november 2018, 03:28 UTC. K dispozícii na: en.wikipedia.org
3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). Laboratórna príručka pre mikrobiologické techniky. Katedra mikrobiológie základných vied. Národný polytechnický inštitút.
4. "Endospore." Wikipedia, slobodná encyklopédia. 25 február 2018, 10:20 UTC. 10. januára 2019, 02:42: en.wikipedia.org
5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J a spolupracovníci. (2006). Pracovný personál autonómnej komunity Extremadura. Osobitný program Zväzok IV. Redakčné MAD. Seville-Španielsko, str. 211-212.
6. Silva M., García M., Corrales J., Ponce E. (2006), špecialista laboratórneho technika, Galician Health Service (SERGAS). Objem špecifického predmetu programu 2. Redakčný MAD. Sevilla-Španielsko, str. 79-80.
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. (5. vydanie). Argentina, Editorial Panamericana SA
8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Argentína. Editorial Panamericana SA