DNA SEKVENOVANIE: MAXAM-GILBERT, METÓDA A PRÍKLADY - BIOLÓGIE - 2026

Sekvenovania DNA (deoxyribonukleová kyselina), je postup, v laboratóriách, molekulárnej biológie, ktorý umožňuje , aby poznať poradie nukleotidov v genetickom materiáli je predmetom záujmu. Ďalej môže byť opísané sekvenovanie RNA (kyselina ribonukleová).

Táto technika bola nevyhnutná pre rozvoj biologických vied. Uplatňuje sa aj na ďalšie oblasti vedomostí - napríklad na lekársku diagnostiku a forenzné vyšetrenie.

Zdroj: pixabay.com

Predtým sa sekvenovanie reťazca DNA považovalo za pomalú a nákladnú aktivitu, ktorá umožnila identifikáciu iba niekoľkých párov báz v oligonukleotidoch.

Dnes, so všetkými pokrokmi vo vede, je sekvenovanie DNA rutinnou operáciou v mnohých laboratóriách na celom svete vďaka príspevku takmer 50 rokov výskumu v tejto oblasti. Z hľadiska dĺžky reťazca je možné vo veľmi krátkom čase sekvenovať až milióny párov báz.

Na tento účel existujú desiatky vyvinutých techník, ktoré sa líšia cenou a presnosťou. V tomto článku popíšeme klasické aj moderné techniky, z ktorých každá má svoje výhody a nevýhody.

Doteraz umožňujú sekvenčné techniky získanie sekvencie úplných genómov, od malých prokaryotov a kvasiniek po ľudský genóm.

Štruktúra DNA

Na pochopenie metód a techník používaných na sekvenovanie DNA je potrebné poznať určité kľúčové aspekty štruktúry a zloženia molekuly.

DNA je biomolekula nájdená vo všetkých živých veciach, od baktérií po veľké vodné živočíchy. Organely - ako mitochondrie a chloroplasty - majú v sebe molekulu cirkulárnej DNA. Aj pri niektorých vírusoch je genetickým materiálom DNA.

Štruktúra DNA je zbierka nukleotidov. Každá z nich sa skladá z uhľohydrátov, dusíkatej bázy (A, T, C alebo G) a fosfátovej skupiny. Cieľom sekvenovania DNA je odhaliť poradie, v ktorom sa v sekvencii nachádzajú štyri dusíkaté bázy.

histórie

V polovici 50. rokov 20. storočia vedci Watson a Crick opísali štruktúru DNA pomocou christolografických techník. Žiadny z týchto výskumných pracovníkov však nebol schopný nájsť spôsob, ako odhaliť postupnosť.

Aj keď existovali určití predchodcovia, najdôležitejšou udalosťou bolo vytvorenie Sangerovej metódy v roku 1977. Frederick Sanger, otec tejto metódy, bol britský biochemik, ktorý získal dve Nobelovy ceny za enormné príspevky do biologických vied.

Táto technika je v literatúre známa aj ako „ukončenie reťazca“ alebo dideoxynukleotidy. Princípy tejto techniky a tie, ktoré boli vyvinuté na základe jej zlepšenia a inovácie, budú opísané nižšie.

Sangerova metóda

Vývoj Sangerovej metódy predstavoval zásadnú udalosť v molekulárnej biológii. Zahŕňa základné komponenty procesu replikácie DNA, ktoré sa bežne vyskytujú v bunke, ale pridáva špeciálnu zložku: dideoxynukleotidy.

Hlavné zložky reakcie

- DNA polymeráza: enzým DNA polymeráza je rozhodujúcim prvkom procesu. Táto molekula sa podieľa na replikácii reťazca DNA a jeho úlohou je syntéza nového vlákna, ktorá spája trifosfát deoxyribonukleotidy s komplementárnymi.

Pripomeňme, že v DNA sa tymíny (T) párujú s adenínami (A) prostredníctvom dvoch vodíkových väzieb, zatiaľ čo cytozín (C) to robí s guanínom (G) prostredníctvom troch väzieb.

- Nukleotidy: Sangerove sekvenovanie zahŕňa dva typy nukleotidov, štyri 2'-deoxynukleotidy (skrátene dATP, dGTP, dCTP a dTTP) a štyri špeciálne dideoxynukleotidy (ddATP, ddGTP, ddCTP a ddTTP).

Hoci sú dideoxynukleotidy podobné monomérom, ktoré sú normálne inkorporované do DNA, vo svojej štruktúre im chýba skupina -OH. To znemožňuje pridanie nového nukleotidu do reťazca.

Preto, keď sa špeciálny nukleotid pridá - úplne náhodným spôsobom - do reťazca pri tvorbe, syntéza je paralyzovaná. Na konci reakcie teda existujú reťazce rôznych veľkostí, pričom každý z nich bol zastavený v inom bode.

Experimentálne sa pripravujú štyri testy. Každá obsahuje DNA extrahovanú z požadovanej biologickej vzorky, normálne nukleotidy a jeden zo štyroch špeciálnych typov nukleotidov. Alebo špeciálne nukleotidy sú označené nejakým typom fluorescenčného markera (pozri automatické sekvenovanie nižšie).

Čítanie výsledkov

Prvým krokom je oddelenie každého zo syntetizovaných reťazcov podľa ich veľkosti. Niektoré budú dlhšie ako iné, v závislosti od toho, kde boli špeciálne základne začlenené.

Existujú rôzne biochemické techniky, ktoré umožňujú separáciu zložiek zmesi použitím veľkosti ako diskriminačnej vlastnosti. Pri Sangerovej metóde sú rôzne reťazce separované elektroforézou. V sofistikovanejších variantoch techniky sa používa kapilárna elektroforéza.

Dlhšie vlákna sa teda pohybujú menej ako kratšie varianty. Tento systém potom prechádza čítačkou, ktorá rozpoznáva marker obsiahnutý v každom dideoxynukleotide. Týmto spôsobom môže byť známe poradie sekvencie.

Táto technika „prvej generácie“ je schopná čítať fragmenty DNA väčšie ako 1 kilobáza. V súčasnosti sa metóda Sanger používa v rôznych laboratóriách, zvyčajne v jej moderných variantoch. Okrem toho sa používa na potvrdenie výsledkov získaných pomocou najzložitejších techník - ale menej presných.

Automatické sekvenovanie

Ak sa vyžaduje sekvenovanie vo veľkom meradle, proces sa urýchli automatizáciou. Toto je variácia metódy ukončenia reťazca Sanger, kde sú priméry označené fluorescenčnými produktmi, aby sa rozlíšili.

Následne sa reakčný produkt spracuje elektroforézou - všetko na jedinom pruhu. Keď každý fragment opúšťa konečnú časť gélu, je rýchlo identifikovaný pomocou fluorescenčného značenia s chybou okolo 1%.

Najmodernejšie systémy majú systém až 96 kapilárnych trubíc spravovaných počítačom spojeným s robotom. To znamená, že je možné súčasne testovať 96 vzoriek DNA. Proces zahŕňajúci elektroforézu a analýzu výsledkov je teda plne automatizovaný.

Za jeden deň môžu tieto systémy sekvenovať až 550 000 báz. Počas tohto procesu nie je potrebná ľudská práca. Spustenie metódy trvá približne 15 minút.

Maxam-Gilbertovo sekvenovanie

V rovnakom čase, keď Sanger publikoval svoju prácu, sa dvom vedcom menom Allan Maxan a Walter Gilbert podarilo vyvinúť ďalšiu metódu na získanie sekvencie DNA. Metóda získala popularitu v tom čase, ale neskôr bola nahradená zlepšením Sangerovej metódy.

Na rozdiel od Sangerovej metódy Maxan a Gilbertove sekvenovanie (alebo chemické sekvenovanie, ako je známe) nezahŕňa hybridizačné reakcie. Metodika spočíva na označení reaktívnymi činidlami na jednom konci a následnom purifikačnom procese.

Jedným z negatívnych aspektov tejto techniky je jej obrovská zložitosť a použitie chemikálií, ktoré sú pre používateľa nebezpečné. Chemické zlomy sú indukované aplikáciou DMS, kyseliny mravčej, hydrazínu a hydrazínu so soľami.

proces

Protokol sa začína značením na 5 'konci vlákna fosforovým markerom 32, potom nastane chemická modifikácia dusíkovej bázy a je oddelená. Nakoniec dochádza k štiepeniu abázickej oblasti.

Najprv skrátite reťazec, ktorý chcete sekvenovať, do menších segmentov. Tento krok sa uskutočňuje s reštrikčnými enzýmami, ktorých výsledkom sú vyčnievajúce konce.

Ďalej sa reakcia uskutočňuje s alkalickou fosfatázou, ktorej účelom je eliminácia fosfátovej skupiny. Polynukleotidkináza sa teda môže použiť na uskutočnenie značenia.

Reťaz je denaturovaná (dva vlákna sú otvorené). Potom sa aplikujú chemikálie. Tieto štiepne reakcie sa uskutočňujú kontrolovaným spôsobom a je známe, aké typy väzieb každá použitá chemická zloma.

Čítanie výsledkov

Rovnako ako v Sangerovej metóde, čítanie výsledkov zahrnuje separáciu podľa veľkosti reťazcov získaných v elektroforéznom systéme. Systémy zložené z polyakrylamidu umožňujú získať veľmi primerané rozlíšenie na odčítanie gélu.

Hromadné sekvenovanie

Masívne sekvenovanie zahŕňa sériu nových metód, skrátene NGS, z anglického „Next Generation Sequencing“.

Metódy klasifikované ako NGS vyžadujú predchádzajúci krok amplifikácie DNA (nepracujú s jednou molekulou). Použité platformy sa okrem toho veľmi líšia. Princípy najpopulárnejších metód budú opísané nižšie:

pyrosekvenování

Zahŕňa monitorovanie uvoľňovania pyrofosfátu, ku ktorému dochádza vždy, keď sa do vlákna DNA pridá nový nukleotid. Systém enzýmov je spojený, takže k emisii svetla (ktoré je detekovateľné kamerou) dochádza vždy, keď je začlenený nový nukleotid.

Proces sa začína samostatnou inkubáciou každej dusíkovej bázy, aby sa overilo, či existuje alebo nie je emisia svetla. Pyroekonvencia dokáže čítať dlhé vlákna, ale zistená miera chybovosti je vysoká.

Syntetické sekvenovanie

To zahŕňa zabudovanie značených nukleotidov. Tieto fluorescenčné zložky sa pridajú, premyjú a zaznamená sa zabudovaný nukleotid. Potom sa odstráni nukleotidová značka a syntéza vlákna môže pokračovať. V ďalšom kroku bude tiež začlenený značený nukleotid a vyššie uvedené kroky budú opakované.

Nevýhodou tejto techniky je, keď fluorescenčné markery nie sú úplne odstránené. Tieto emisie spôsobujú chyby na pozadí, čo vedie k významným chybám.

Ligačné sekvenovanie

Táto technika sa líši od ostatných, pretože nepoužíva DNA polymerázu. Kľúčovým enzýmom pre túto metodológiu je ligáza. Tu sa používajú fluorescenčné značené fragmenty DNA, sú spojené enzýmom a sú detegované.

Najväčším problémom tejto techniky je krátka dĺžka fragmentu, ktorú dokáže spracovať.

Ion Torrent Sequencing

Táto technika je založená na meraní iónu H ^+, ktorý je uvoľňovaný zakaždým, keď je začlenený nový nukleotid. Princíp je dosť podobný pyroekvencii, ale oveľa lacnejší.

Príklady

Sekvenovanie ľudského genómu

Sekvenovanie ľudského genómu bolo jednou z najsľubnejších výziev v biológii a bolo tiež jednou z najuznávanejších rivality v histórii vedy. V skutočnosti sa pre vedcov zapojených do projektu sekvencovanie genómu stalo súťažou.

V roku 1990 začal tzv. Projekt ľudského genómu, ktorý viedol známy vedec, držiteľ Nobelovej ceny James Watson. Po roku, v roku 1991, Venter preberá výzvu „poraziť“ Watsona a sekvenovať genóm pred sebou. V roku 1992 však Watson odišiel do dôchodku a velenie prevzal iný vedecký pracovník.

V roku 1995 Venter oznámil svoj úspech v úplnom sekvencovaní bakteriálneho genómu pomocou metódy náhodného sekvenovania. Podobne súperiaci tím o rok neskôr oznámil sekvenciu kvasinkového genómu.

V roku 2000 bol titul ukončený. Obe spoločnosti publikovali svoje predbežné výsledky celého genómu v dvoch z najprestížnejších vedeckých časopisov: Príroda a veda.

Vedci však pokračovali v práci na zlepšení návrhov av roku 2006 boli dokončené sekvencie určitých ľudských chromozómov.

Dôležitosť a aplikácie

Poznanie poradia nukleotidov takej dôležitej molekuly ako DNA je pre biológov a príbuzných odborníkov cenné. Tento reťazec polynukleotidov obsahuje všetky informácie potrebné na vývoj a udržiavanie všetkých foriem života.

Z týchto dôvodov je znalosť tejto sekvencie nevyhnutná pre biologický výskum. Sekvenovanie v zásade umožňuje zmerať jednu z najdôležitejších vlastností biologických systémov a zistiť rozdiely medzi nimi.

Sekvenovanie často používajú taxonómovia a systematici, pretože určité sekvencie DNA umožňujú stanoviť kritériá na vyvodenie záveru, či dva organizmy patria k rovnakému druhu alebo nie, okrem toho, že môžu navrhovať hypotézy o fylogenetických vzťahoch medzi nimi.

Okrem toho má sekvenovanie DNA uplatnenie v medicíne a diagnostike. Napríklad existujú lacné a dostupné systémy, ktoré pomocou sekvenovania umožňujú vyhodnotiť tendenciu k vývoju určitých chorôb (ako je rakovina) pomocou takzvaných jednonukleotidových polymorfizmov (SNP).

Vyšetrovania trestného a forenzného typu boli obohatené aj o sekvenčné techniky, ktoré možno použiť ako spoľahlivý dôkaz o účasti určitého jednotlivca na trestnom čine.

Referencie

1. Heather, JM, a Chain, B. (2016). Sekvencia sekvencérov: história sekvenovania DNA. Genomics, 107 (1), 1-8.
2. Koboldt, DC, Steinberg, KM, Larson, DE, Wilson, RK a Mardis, ER (2013). Nová generácia sekvenčnej revolúcie a jej vplyv na genomiku. Celí, 155 (1), 27-38.
3. Levy, J. (2010). Vedecké súperenie. Od projektu Galileo k projektu ľudského genómu. Redakčný Paraninfo.
4. Sanger, F., Nicklen, S. a Coulson, AR (1977). Sekvenovanie DNA s inhibítormi ukončujúcimi reťazec. Zborník národnej akadémie vied, 74 (12), 5463-5467.
5. Schuster, SC (2007). Sekvenovanie novej generácie transformuje dnešnú biológiu. Prírodné metódy, 5 (1), 16.
6. Xu, J. (Ed.). (2014). Sekvenovanie novej generácie. Caister Academic Press.