HISTOCHÉMIA: ODÔVODNENIE, SPRACOVANIE, FARBENIE - BIOLÓGIE

Histochemické je užitočný nástroj pri štúdiu morfológie rôznych biologických tkanív (rastliny a zvieratá), vzhľadom k jeho reakčného princípe tkanivových zložiek, ako sú sacharidy, lipidy a proteíny, okrem iného, v chemických farbív.

Tento cenný nástroj umožňuje nielen identifikovať zloženie a štruktúru tkanív a buniek, ale aj rôzne reakcie, ktoré sa v nich vyskytujú. Podobne je možné dokázať možné poškodenie tkaniva spôsobené prítomnosťou mikroorganizmov alebo iných patológií.

Histochemické škvrny. Vírus Nílu, grampozitívne a gramnegatívne baktérie (gram), histoplazma capsulatum (Grocott), Mycobacterium tuberculosis (Ziehl Neelsen). Zdroj: Pixinio.com/Wikipedia.org/Nephron / CDC / Dr. George P. Kubica

Histochémia z minulých storočí poskytla dôležité príspevky, ako napríklad preukázanie existencie hematoencefalickej bariéry Paula Ehrlicha. Bolo to možné, pretože mozog experimentálneho zvieraťa, ktorý použil Ehrlich, sa nezafarbil anilínom, ktorý je základným farbivom.

To viedlo k použitiu rôznych farbív, ako sú metylénová modrá a indofenol, aby sa zafarbili rôzne typy buniek. Toto zistenie viedlo k klasifikácii buniek na acidofilné, bazofilné a neutrofilné podľa ich špecifického zafarbenia.

Posledné štúdie použili túto techniku na preukázanie prítomnosti rôznych zlúčenín vrátane fenolov, ako aj uhľohydrátov a neštruktúrnych lipidov v tkanivách druhov Litsea glaucescens, známych ako vavrín. Nájdenie týchto, v listoch aj v lese.

Podobne Colares a kol., 2016, identifikovali rastlinu liečivej záujmu Tarenaya hassleriana pomocou histochemických techník. U tohto druhu bola dokázaná prítomnosť škrobu, myrozínu, ako aj fenolových a lipofilných zlúčenín.

základ

Histochémia je založená na farbení bunkových štruktúr alebo molekúl prítomných v tkanivách vďaka ich afinite so špecifickými farbivami. Reakcia sfarbenia týchto štruktúr alebo molekúl v ich pôvodnom formáte sa neskôr vizualizuje v optickom alebo elektrónovom mikroskope.

Špecifickosť zafarbenia je spôsobená prítomnosťou iónov akceptujúcich skupín prítomných v bunkách alebo molekulách tkanív.

Nakoniec je cieľom histochemických reakcií dokázať to prostredníctvom zafarbenia. Od najväčších biologických štruktúr po najmenšie tkanivá a bunky. To sa dá dosiahnuť vďaka skutočnosti, že farbivá chemicky reagujú s molekulami tkanív, buniek alebo organel.

prevádzkovanie

Histochemická reakcia by mohla zahŕňať kroky pred uskutočnením techniky, ako je fixácia, vloženie a rezanie tkaniva. Preto je potrebné vziať do úvahy, že v týchto krokoch môže byť identifikovaná štruktúra poškodená, čo vedie k falošne negatívnym výsledkom, aj keď je prítomná.

Napriek tomu je dôležitá predchádzajúca fixácia tkaniva, pretože bráni autolýze alebo deštrukcii buniek. Na tento účel sa okrem iného používajú chemické reakcie s organickými rozpúšťadlami, ako sú napríklad formaldehyd alebo glutaraldehyd.

Zahrnutie textílie sa uskutočňuje tak, že si pri rezaní zachováva svoju pevnosť a tak bráni jej deformácii. Nakoniec sa rez urobil pomocou mikrotómu na štúdium vzoriek optickou mikroskopiou.

Okrem toho sa pred začatím histochemického farbenia odporúča zahrnúť do každej šarže testov externé alebo interné pozitívne kontroly. Rovnako ako použitie špecifických farbív pre študované štruktúry.

Histochemické škvrny

Od objavenia sa histochemických techník až po súčasnosť sa používa široká škála škvŕn vrátane tých, ktoré sa najčastejšie používajú, ako sú: kyselina jodistá kyselina Schiff (PAS), Grocott, Ziehl-Neelsen a Gram.

Podobne sa menej často používajú iné farbivá, napríklad indický atrament, orceín alebo Massonova trichrómová škvrna.

Schiff periodickej kyseliny (PAS)

S týmto sfarbením je možné pozorovať molekuly s vysokým obsahom uhľohydrátov, ako napríklad: glykogén a mucín. Je však tiež užitočný na identifikáciu mikroorganizmov, ako sú huby a parazity. Okrem určitých štruktúr (bazálna membrána) v koži a iných tkanivách.

Základom tohto zafarbenia je to, že farbivo oxiduje uhlíkové väzby medzi dvoma blízkymi hydroxylovými skupinami. To vedie k uvoľňovaniu aldehydovej skupiny, čo sa deteguje Schiffovým činidlom, čím sa získa fialová farba.

Schiffove činidlo sa skladá zo zásaditého fuchsínu, metabisulfitu sodného a kyseliny chlorovodíkovej, pričom tieto zložky sú zodpovedné za fialové sfarbenie, ak sú prítomné aldehydové skupiny. Inak sa vytvorí bezfarebná kyselina.

Intenzita sfarbenia bude závisieť od množstva hydroxylových skupín prítomných v monosacharidoch. Napríklad v plesniach, suterénnych membránach, mucínoch a glykogéne môže farba z červenej na fialovú, zatiaľ čo jadrové zafarbenie je modré.

Grocott

Je to jedno zo škvŕn s najvyššou citlivosťou pri identifikácii húb v tkanivách zabudovaných do parafínu. To umožňuje identifikáciu rôznych fungálnych štruktúr: hýf, spór, endospor. Preto sa považuje za rutinné farbenie na diagnostikovanie mykózy.

Používa sa najmä pri diagnostike pľúcnych mykóz, ako je pneumocystóza a aspergilóza spôsobená niektorými hubami rodov Pneumocystis a Aspergillus.

Tento roztok obsahuje dusičnan strieborný a kyselinu chrómovú, pričom posledná uvedená je fixačným a farbiacim prostriedkom. Dôvodom je to, že táto kyselina produkuje oxidáciu hydroxylových skupín na aldehydy pomocou mukopolyacharidov prítomných vo fungálnych štruktúrach, napríklad v bunkovej stene húb.

Nakoniec sa striebro prítomné v roztoku oxiduje aldehydmi, čo spôsobuje čierne sfarbenie, ktoré sa nazýva argentafínová reakcia. Môžu sa tiež použiť kontrastné farbivá, ako je svetlozelená, a teda plesňové štruktúry sa budú pozorovať čiernou farbou so svetlozeleným pozadím.

Ziehl-Neelsen

Toto zafarbenie je založené na prítomnosti čiastočne alebo úplne rezistencie voči kyselinám a alkoholom v niektorých mikroorganizmoch, ako sú rody Nocardia, Legionella a Mycobacterium.

Použitie tohto farbenia sa odporúča, pretože bunková stena vyššie uvedených mikroorganizmov obsahuje komplexné lipidy, ktoré bránia prenikaniu farbív. Najmä vo vzorkách z dýchacích ciest.

V ňom sa používajú silné farbivá, ako je karbol fuchsín (základné farbivo) a aplikuje sa teplo tak, aby si mikroorganizmus mohol udržať farbu a nezmeniť farbu kyselinami a alkoholmi. Nakoniec sa roztok metylénovej modrej aplikuje na zafarbenie štruktúr, ktoré zmenili farbu.

Prítomnosť rezistencie voči kyselinám a alkoholom sa pozoruje v červenej farbe štruktúr, zatiaľ čo štruktúry, ktoré neodolávajú vyblednutiu, sú zafarbené modro.

Gram a čínsky atrament

Gram je okrem iného veľmi užitočným farbivom pri diagnostike bakteriálnych a plesňových infekcií. Toto zafarbenie umožňuje rozlišovať medzi gram-pozitívnymi a gram-negatívnymi mikroorganizmami, čo jasne ukazuje rozdiely, ktoré existujú v zložení bunkovej steny.

Indický atrament je škvrna, ktorá sa používa na kontrast štruktúr, ktoré obsahujú polysacharidy (kapsuly). Je to tak preto, že v prostredí sa vytvára kruh, ktorý je možný v Cryptococcus neoformans.

orceínu

Týmto zafarbením sa zafarbia elastické vlákna a chromozómy rôznych buniek, čo umožňuje vyhodnotiť proces dozrievania týchto buniek. Z tohto dôvodu je veľmi užitočný v cytogenetických štúdiách.

Je to založené na absorpcii farbiva negatívnym nábojom molekúl, ako je DNA, prítomných v jadrách širokej škály buniek. Takže sú zafarbené modré až tmavo fialové.

Massonov trichróm

Toto farbenie sa používa na identifikáciu niektorých mikroorganizmov alebo materiálov, ktoré obsahujú melanické pigmenty. Toto je prípad mykóz, ktoré spôsobujú dematiaceózne huby, feohifomykóza a eumycetóm čiernych zŕn.

Záverečné myšlienky

V posledných rokoch došlo k mnohým pokrokom vo vytváraní nových diagnostických techník, v ktorých je zahrnutá histochémia, ale sú spojené s inými základmi alebo zásadami. Tieto techniky majú iný účel, ako v prípade imunohistochémie alebo enzýmovejohistochémie.

Referencie

Acuña U, Elguero J. Histoquímica. An. Chem. 2012; 108 (2): 114-118. K dispozícii na adrese: are.iqm.csic.es
Mestanza R. Frekvencia histochemických škvŕn PAS, Grocott a Ziehl-Neelsen používaných na identifikáciu mikroorganizmov, vykonaná v Patologickej anatomickej službe špeciálnej nemocnice Eugenio Espejo v roku 2015 .. Ekvádorská centrálna univerzita, Quito; 2016. K dispozícii na: dspace.uce.edu
Tapia-Torres N, de la Paz-Pérez-Olvera C, Román-Guerrero A, Quintanar-Isaías A, García-Márquez E, Cruz-Sosa F. Histochémia, celkový obsah fenolu a antioxidačná aktivita listov a dreva litsea glaucescens Kunth (Lauraceae). Drevo a lesy. 2014; 20 (3): 125 - 137. K dispozícii na adrese: redalyc.org
Colares, MN, Martínez-Alonso, S, Arambarri, AM. Anatómia a histochémia Tarenaya hassleriana (Cleomaceae), druh lekárskeho záujmu. Latinskoamerický a karibský bulletin liečivých a aromatických rastlín 2016; 15 (3): 182-191. K dispozícii na adrese: redalyc.org
Bonifaz A. Základné lekárske mykológie. 4. vydanie. Mexiko: editori McGraw-Hill Interamericana, SA de CV 2012.
Silva Diego Filipe Bezerra, Santos Hellen Bandeira de Pontes, León Jorge Esquiche, Gomes Daliana Queiroga de Castro, Alves Pollianna Muniz, Nonaka Cassiano Francisco Weege. Klinicko-patologická a imunohistochemická analýza spinocelulárneho karcinómu vretienka jazyka: zriedkavý prípad. Einstein (São Paulo) 2019; 17 (1): eRC4610. K dispozícii od: scielo.br

HISTOCHÉMIA: ODÔVODNENIE, SPRACOVANIE, FARBENIE - BIOLÓGIE - 2026