REŠTRIKČNÉ ENZÝMY: FUNKCIE, TYPY A PRÍKLADY - BIOLÓGIE

Tieto reštrikčné enzýmy sú endonukleázy určitým archea a baktérií na inhibíciu alebo "obmedzenia" šírenia vírusov dovnútra. Obzvlášť sa vyskytujú v baktériách a sú súčasťou ich obranného systému proti cudzej DNA známej ako reštrikčný / modifikačný systém.

Tieto enzýmy katalyzujú štiepenie dvojpásmovej DNA na konkrétnych miestach, reprodukovateľne a bez použitia ďalšej energie. Väčšina vyžaduje prítomnosť kofaktorov, ako je horčík alebo iné dvojmocné katióny, aj keď niektoré tiež vyžadujú ATP alebo S-adenosylmetionín.

Schéma HindIII reštrikčnej enzýmovej reakcie (Zdroj: Helixitta prostredníctvom Wikimedia Commons)

Obmedzujúce endonukleázy objavili v roku 1978 Daniel Nathans, Arber Werner a Hamilton Smith, ktorí za ich objav dostali Nobelovu cenu za medicínu. Ich názov sa všeobecne odvodzuje od organizmu, v ktorom sa prvýkrát pozorujú.

Takéto enzýmy sa široko používajú pri vývoji metód klonovania DNA a iných stratégií molekulárnej biológie a genetického inžinierstva. Vďaka svojim špecifickým vlastnostiam rozpoznávania sekvencií a schopnosti znížiť sekvencie blízko miest rozpoznávania ich robia výkonnými nástrojmi v genetickom experimentovaní.

Fragmenty generované reštrikčnými enzýmami, ktoré pôsobili na konkrétnu molekulu DNA, sa môžu použiť na opätovné vytvorenie „mapy“ pôvodnej molekuly pomocou informácií o miestach, kde enzým štiepi DNA.

Niektoré reštrikčné enzýmy môžu mať na DNA rovnaké rozpoznávacie miesto, ale nemusia ich nevyhnutne rovnakým spôsobom štiepiť. Existujú teda enzýmy, ktoré štiepia opúšťajúce tupé konce, a enzýmy, ktoré štiepia opúšťajúce kohézne konce, ktoré majú rôzne aplikácie v molekulárnej biológii.

V súčasnosti existujú stovky rôznych komerčne dostupných reštrikčných enzýmov, ktoré ponúkajú rôzne komerčné domy; Tieto enzýmy fungujú ako „zvyčajné“ molekulárne nožnice na rôzne účely.

Vlastnosti

Restrikčné enzýmy plnia opačnú funkciu polymeráz, pretože hydrolyzujú alebo prerušujú esterovú väzbu vo fosfodiesterovej väzbe medzi susednými nukleotidmi v nukleotidovom reťazci.

V molekulárnej biológii a genetickom inžinierstve sú široko používanými nástrojmi na konštrukciu expresných a klonovacích vektorov, ako aj na identifikáciu špecifických sekvencií. Sú tiež užitočné pri konštrukcii rekombinantných genómov a majú veľký biotechnologický potenciál.

Najnovší pokrok v génovej terapii v súčasnosti využíva reštrikčné enzýmy na zavádzanie konkrétnych génov do vektorov, ktoré sú nosičmi pre transport takýchto génov do živých buniek a ktoré pravdepodobne majú schopnosť vložiť do bunkového genómu, aby mohli vykonávať trvalé zmeny.

Mechanizmus akcie

Reštrikčné enzýmy môžu katalyzovať dvojpásmové štiepenie DNA, aj keď niektoré sú schopné rozpoznávať jednokopové DNA sekvencie a dokonca aj RNA. Orezanie nastane po rozpoznaní sekvencií.

Mechanizmus účinku spočíva v hydrolýze fosfodiesterovej väzby medzi fosfátovou skupinou a deoxyribózou v kostre každého reťazca DNA. Mnoho enzýmov je schopných rezať na rovnakom mieste, aké rozpoznajú, zatiaľ čo iné rezajú 5 až 9 párov báz pred alebo za ním.

Normálne sa tieto enzýmy štiepia na 5 'konci fosfátovej skupiny, čo vedie k fragmentom DNA s 5' fosforylovým koncom a 3 'terminálnym hydroxylovým koncom.

Pretože proteíny neprichádzajú do priameho kontaktu s rozpoznávacím miestom v DNA, musia sa translokovať postupne, až kým sa nedosiahne konkrétne miesto, napríklad pomocou mechanizmu „kĺzania“ po reťazci DNA.

Počas enzymatického štiepenia je fosfodiesterová väzba každého z reťazcov DNA umiestnená v jednom z aktívnych miest reštrikčných enzýmov. Keď enzým opúšťa rozpoznávacie a štiepne miesto, robí to prostredníctvom nešpecifických prechodných asociácií.

druhy

V súčasnosti je známych päť typov reštrikčných enzýmov. Tu je stručný popis každého z nich:

Reštrikčné enzýmy typu I

Tieto enzýmy sú veľké pentamerické proteíny s tromi podjednotkami, jedna pre reštrikciu, jedna pre metyláciu a druhá pre rozpoznanie sekvencie v DNA. Tieto endonukleázy sú multifunkčné proteíny schopné katalyzovať reštrikčné a modifikačné reakcie, majú ATPázovú aktivitu a tiež DNA topoizomerázu.

Enzýmy tohto typu boli prvé endonukleázy, ktoré boli objavené, boli prvýkrát purifikované v 60. rokoch a odvtedy sa študovali vo veľkej hĺbke.

Enzýmy typu I sa široko nepoužívajú ako biotechnologický nástroj, pretože miesto štiepenia môže byť vo variabilnej vzdialenosti až 1 000 párov báz od rozpoznávacieho miesta, čo ich robí nespoľahlivými z hľadiska experimentálnej reprodukovateľnosti.

Reštrikčné enzýmy typu II

Sú to enzýmy zložené z homodimérov alebo tetramérov, ktoré štiepia DNA na definovaných miestach s dĺžkou 4 až 8 bp. Tieto miesta štiepenia sú typicky palindromické, to znamená, že rozpoznávajú sekvencie, ktoré sa čítajú rovnakým spôsobom v oboch smeroch.

Mnoho reštrikčných enzýmov typu II v baktériách štiepi DNA, keď rozpoznajú jej cudzí charakter, pretože nemá typické modifikácie, ktoré by mala mať jej vlastná DNA.

Jedná sa o najjednoduchšie reštrikčné enzýmy, pretože nevyžadujú žiadny iný kofaktor ako horčík (Mg +) na rozpoznanie a rezanie DNA sekvencií.

Precíznosť reštrikčných enzýmov typu II pri rozpoznávaní a rezaní jednoduchých sekvencií v DNA na presných pozíciách ich robí jedným z najbežnejšie používaných a nevyhnutných vo väčšine odvetví molekulárnej biológie.

V rámci skupiny reštrikčných enzýmov typu II existuje niekoľko podtried klasifikovaných podľa určitých vlastností, ktoré sú pre každú z nich jedinečné. Klasifikácia týchto enzýmov sa vykonáva pridaním písmen abecedy, od A po Z za názvom enzýmu.

Niektoré z podtried najlepšie známych pre svoju užitočnosť sú:

Podtrieda IIA

Sú to diméry rôznych podjednotiek. Rozpoznávajú asymetrické sekvencie a používajú sa ako ideálne prekurzory na tvorbu rezacích enzýmov.

Podtrieda IIB

Sú tvorené jedným alebo viacerými dimérmi a rezajú DNA na oboch stranách rozpoznávacej sekvencie. Orežú obidva vlákna DNA o interval pár báz pred rozpoznávacím miestom.

Podtrieda IIC

Enzýmy tohto typu sú polypeptidy s funkciami delenia a modifikácie DNA reťazcov. Tieto enzýmy štiepia oba vlákna asymetricky.

Podtrieda IIE

Enzýmy tejto podtriedy sa najčastejšie používajú v genetickom inžinierstve. Majú katalytické miesto a zvyčajne vyžadujú alosterický efektor. Tieto enzýmy musia interagovať s dvoma kópiami svojej rozpoznávacej sekvencie, aby sa uskutočnilo účinné štiepenie. V rámci tejto podtriedy sú enzýmy EcoRII a EcoRI.

Reštrikčné enzýmy typu III

Reštrikčné endonukleázy typu III sa skladajú iba z dvoch podjednotiek, jedna je zodpovedná za rozpoznávanie a modifikáciu DNA, zatiaľ čo druhá je zodpovedná za štiepenie sekvencií.

Tieto enzýmy vyžadujú pre svoju funkciu dva kofaktory: ATP a horčík. Reštrikčné enzýmy tohto typu majú dve asymetrické rozpoznávacie miesta, translokujú DNA spôsobom závislým od ATP a odrezávajú ju medzi 20 až 30 bp susediacimi s rozpoznávacím miestom.

Reštrikčné enzýmy typu IV

Enzýmy typu IV sa dajú ľahko identifikovať, pretože štiepia DNA metylačnými značkami, sú tvorené niekoľkými rôznymi podjednotkami, ktoré sú zodpovedné za rozpoznávanie a rezanie sekvencie DNA. Tieto enzýmy používajú ako kofaktory GTP a dvojmocný horčík.

Špecifické miesta štiepenia zahŕňajú nukleotidové vlákna s metylovanými alebo hydroxymetylovanými cytozínovými zvyškami na jednom alebo obidvoch vláknach nukleových kyselín.

Reštrikčné enzýmy typu V

Táto klasifikácia zoskupuje enzýmy typu CRISPER-Cas, ktoré identifikujú a odštiepujú špecifické sekvencie DNA od napadajúcich organizmov. Enzýmy Cas používajú reťazec syntetizovanej vodiacej RNA syntetizovanej CRISPER na rozpoznanie a napadnutie napadajúcich organizmov.

Enzýmy klasifikované ako typ V sú polypeptidy štruktúrované podľa enzýmov typu I, II a II. Môžu rezať časti DNA takmer akéhokoľvek organizmu a so širokým rozsahom dĺžok. Vďaka svojej flexibilite a jednoduchosti použitia sú tieto enzýmy spolu s enzýmami typu II jedným z najbežnejšie používaných nástrojov v genetickom inžinierstve.

Príklady

Reštrikčné enzýmy sa používajú na detekciu polymorfizmov DNA, najmä v populačných genetických štúdiách a vývojových štúdiách s použitím mitochondriálnej DNA, aby sa získali informácie o miere nukleotidových substitúcií.

V súčasnosti vektory používané na transformáciu baktérií na rôzne účely majú miesta na viacnásobné klonovanie, kde sa nachádzajú rozpoznávacie miesta pre viac reštrikčných enzýmov.

Z týchto enzýmov sú najobľúbenejšie EcoRI, II, III, IV a V, ktoré boli prvýkrát získané a opísané z E. coli; HindIII z H. influenzae a BamHI z B. amyloliquefaciens.

Referencie

Bickle, TA, a Kruger, DH (1993). Biológia obmedzenia DNA. Microbiological Reviews, 57 (2), 434 - 450.
Boyaval, P., Moineau, S., Romero, DA a Horvath, P. (2007). CRISPR poskytuje získanú odolnosť proti vírusom v prokaryotoch. Science, 315 (marec), 1709 - 1713.
Goodsell, D. (2002). Molekulárna perspektíva: Restrikčné endonukleázy. Kmeňové bunky, základy rakoviny, 20, 190–191.
Halford, SE (2001). Poskakovanie, skákanie a opakovanie reštrikčnými enzýmami. Biochemical Society Transactions, 29, 363-373.
Jeltsch, A. (2003). Udržiavanie druhovej identity a kontrola špecializácie baktérií: nová funkcia pre systémy obmedzovania / modifikácie? Gene 317, 13-16.
Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Lewinove gény XII (12. vydanie). Burlington, Massachusetts: Jones & Bartlett Learning.
Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N.,… She, Q. (2015). Využívajú systémy CRISPR-Cas typu I a typu III na úpravu genómu. Nucleic Acids Research, 1-12.
Loenen, WAM, Dryden, DTF, Raleigh, EA a Wilson, GG (2013). Reštrikčné enzýmy typu I a ich príbuzné. Nucleic Acids Research, 1-25.
Nathans, D., & Smith, HO (1975). Obmedzenie Endonukleázy v analýze a reštrukturalizácii molekúl DNA. Annu. Biochem. , 273 - 293.
Nei, M. a Tajima, F. (1981). Dna polymorfizmus detekovateľný reštrikčnými endonukleázami. Genetics, 145-163.
Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. a Wende, W. (2005). Bunkové a molekulárne biologické vedy, reštrikčné endonukleázy typu II: štruktúra a mechanizmus. CMLS Cellular and Molecular Life Sciences, 62, 685 - 707.
Roberts, R. (2005). Ako sa reštrikčné enzýmy stali pracovníkmi molekulárnej biológie. PNAS, 102 (17), 5905 - 5908.
Roberts, RJ, a Murray, K. (1976). Reštrikčné endonukleázy. Critical Reviews in Biochemistry, (november), 123-164.
Stoddard, BL (2005). Štruktúra a funkcia cieľovej endonukleázy. Štvrťročné recenzie biofyziky, 1-47.
Tock, MR, a Dryden, DTF (2005). Biológia obmedzení a obmedzení. Current Opinion in Microbiology, 8, 466 - 472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
Wilson, GG a Murray, NE (1991). Obmedzovacie a modifikačné systémy. Annu. Genet. 25, 585 - 627.
Wu, Z., a Mou, K. (2016). Genomické poznatky o virulencii Campylobacter jejuni a populačnej genetike. Infect. Dis. Transl. Med., 2 (3), 109 - 119.
Yuan, R. (1981). Štruktúra a mechanizmus viacfunkčných reštrikčných endonukleáz. Annu. Biochem. 50, 285 až 315.

REŠTRIKČNÉ ENZÝMY: FUNKCIE, TYPY A PRÍKLADY - BIOLÓGIE - 2025