DAPI (4 ', 6-DIAMIDINO-2-FENYLINDOL): CHARAKTERISTIKA, ZDÔVODNENIE, POUŽITIE - CHÉMIA - 2025

DAPI (4 ', 6-diamino-2-fenylindolu) je farbivo fluorescenčné vlastnosť slúži ako je marker, široko používané v stave techniky z fluorescenčné mikroskopia alebo prietoková cytometria, okrem iného. Fluorescencia, ktorú vyžaruje, je jasne modrá, k jej excitácii dochádza medzi 455 - 461 nm (UV svetlo).

Farbivo DAPI môže s ľahkosťou prechádzať cez bunkovú membránu mŕtvych buniek. Môže tiež zafarbiť jadrá živých buniek, ale v tomto prípade musí byť jej koncentrácia vyššia.

Chemická štruktúra fluorescenčného farbiva DAPI. Zdroj: Obrázok: Súbor: DAPI.svg je vektorová verzia tohto súboru. Mal by sa použiť namiesto tohto rastrového obrázka, ak nie je podradený / Richard Wheeler (Zephyris) Upravený obrázok

Farbivo je schopné prístupu k bunkovej DNA, pre ktorú má špeci fi ckú afinitu a viaže sa s vysokou aviditou na dusíkaté bázy adenín a tymín. Z tohto dôvodu je veľmi užitočný pri niektorých technikách molekulárnej biológie.

Táto zlúčenina patrí do skupiny indolových farbív a ukázalo sa, že má väčšiu citlivosť na DNA ako etidiumbromid a propidiumjodid, najmä na agarózových géloch.

Použitie tohto fluorescenčného farbiva je veľmi široké, pretože je užitočné na: štúdium zmien v DNA v apoptotických procesoch (bunková smrť), a preto detegovanie buniek v tomto procese; pre fotografiu DNA s potlačou (DNA fotografická tlač); študovať bakteriálnu kontamináciu; alebo si predstaviť segmentáciu jadra.

Používa sa tiež pri štúdiu chromozomálnych pásov, pri detekcii mykoplazmovej sp DNA, pri interakcii DNA-proteín, pri farbení a počítaní buniek imunofluorescenciou a dokonca aj pri farbení zrelých peľových zŕn.

vlastnosti

DAPI je skratka jej chemického názvu (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol). Jeho molekulárnej vzorec je C ₁₆ H ₁₅ N ₅ má molekulovú hmotnosť 350,3. V blízkosti rozsahu UV svetla (345 až 358 nm) dochádza k maximálnej excitácii komplexu DAPI-DNA, zatiaľ čo maximálna emisia fluorescencie sa vyskytuje medzi 455-461 nm.

Toto farbivo je charakterizované ako žltý prášok, ale štruktúry označené týmto fluoroforom vyžarujú žiarivé modré svetlo.

Je to zlúčenina rozpustná vo vode, avšak na urýchlenie jej rozpúšťania sa môže použiť určité teplo. Môže byť zriedený PBS, ale nie priamo rozpustený v ňom.

Akonáhle je farbivo pripravené, musí sa uchovávať v tme, tj chrániť pred svetlom, pri teplote 2 až 8 ° C (chladnička). Za týchto podmienok je farbivo stabilné dlhšie ako 3 týždne alebo mesiace.

Ak je chránená pred svetlom, ale ponechaná pri izbovej teplote, jej stabilita klesne na 2 alebo 3 týždne, ale pri vystavení priamemu svetlu je zhoršenie veľmi rýchle. Ak chcete skladovať oveľa dlhšie, možno ho chladiť pri -20 ° C a distribuovať v alikvótoch.

základ

Toto zafarbenie je založené na vytvorení jadrového kontrastného farbiva v hlavných technikách molekulárnej biológie, ako sú: prietoková cytometria, fluorescenčná mikroskopia a farbenie metafázových chromozómov alebo medzifázových jadier.

Táto technika je založená na veľkej afinite, ktorú má farbivo pre dusíkaté bázy (adenín a tymín) obsiahnuté v genetickom materiáli (DNA) v menšej drážke. Na cytoplazmatickej úrovni zanecháva veľmi málo pozadia.

Keď sa fluorescenčné farbivo viaže na adenínové a tymínové oblasti DNA, fluorescencia sa výrazne zvyšuje (20-krát viac). Farba, ktorú vysiela, je jasne modrá. Pri väzbe na páry báz GC (guanín-cytozín) neexistuje žiadna emisia fluorescencie.

Je dôležité si uvedomiť, že aj keď má tiež afinitu k RNA, nespôsobuje to problém, pretože na rozdiel od DNA, ktorá tak robí pri 460, k najväčšej emisii energie z tejto molekuly dochádza pri inej vlnovej dĺžke (500 nm). nm. Navyše zvýšenie fluorescencie po naviazaní na RNA je iba 20%.

DAPI sa používa viac na farbenie mŕtvych (fixovaných) buniek ako živé bunky, pretože na jeho farbenie je potrebná oveľa vyššia koncentrácia farbiva, pretože bunková membrána je oveľa menej priepustná pre DAPI, keď je nažive.

Farbu DAPI možno použiť v kombinácii s červenými a zelenými fluoroformi pre viacfarebný zážitok.

použitie

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) je vynikajúci fluorofor, a preto sa široko používa v rôznych technikách a na rôzne účely. Nasledujúci text vysvetľuje použitie DAPI v hlavných technikách.

Prietoková cytometria

Vedci Gohde, Schumann a Zante v roku 1978 boli prví, ktorí použili a navrhli DAPI ako fluorofor v technike prietokovej cytometrie, majú veľký úspech vďaka svojej vysokej citlivosti na DNA a vysokej intenzite fluorescenčnej emisie.

Použitie DAPI v tejto technike umožňuje štúdium bunkového cyklu, kvantifikáciu buniek a farbenie živých a mŕtvych buniek.

Aj keď existujú ďalšie farbivá, ako je napríklad etídiumbromid, oxid Hoechst, akridínová oranžová a propidiumjodid, DAPI je jedným z najrozšírenejších, pretože je viac fotostabilný ako tie, ktoré boli uvedené vyššie.

Pre túto techniku ​​je potrebné bunky fixovať, na tento účel sa môže použiť absolútny etanol alebo 4% paraformaldehyd. Vzorka sa odstredí a supernatant sa odstráni, následne sa bunky hydratujú pridaním 5 ml PBS pufra počas 15 minút.

Po uplynutí času pripravte farbenie DAPI farbiacim pufrom (FOXP3 od BioLegend) v koncentrácii 3 uM.

Vzorka sa odstredí, supernatant sa zlikviduje a potom sa zakryje 1 ml roztoku DAPI počas 15 minút pri teplote miestnosti.

Odoberte vzorku do prietokového cytometra pomocou vhodného lasera.

Prietoková mikrofluorometria

Ďalšou technikou, pri ktorej sa používa DAPI, je prietoková mikrofluorometria spolu s ďalším fluoroforom nazývaným mithramycín. Obidve sú užitočné na individuálnu kvantifikáciu chloroplastovej DNA, ale DAPI je najvhodnejší na meranie častíc bakteriofágu T4.

hybridizácia

Táto technika v podstate využíva sondy DNA značené fluorescenčným farbivom, ktorým môže byť DAPI.

Vzorka vyžaduje tepelné ošetrenie na denaturáciu dvojvláknovej DNA a jej premenu na dva jednovláknové vlákna. Následne sa hybridizuje s denaturovanou sondou DNA značenou DAPI, ktorá má požadovanú sekvenciu.

Neskôr sa premyje, aby sa vylúčilo to, čo nebolo hybridizované, na vizualizáciu DNA sa použije kontrast. Fluorescenčný mikroskop umožňuje pozorovanie hybridizovanej sondy.

Účelom tejto techniky je detekcia špecifických sekvencií v chromozomálnej DNA, schopnosť diagnostikovať určité choroby.

Tieto cyto-molekulárne techniky boli veľkou pomocou pri určovaní podrobností pri štúdiu karyotypov. Napríklad ukázal oblasti bohaté na adenozín a tymín bohaté na pár báz, ktoré sa nazývajú heterochromatické oblasti alebo pásiky DAPI.

Táto technika sa široko používa na štúdium chromozómov a chromatínu u rastlín a zvierat, ako aj na diagnostiku prenatálnych a hematologických patológií u ľudí.

V tejto technike je odporúčaná koncentrácia DAPI 150 ng / ml po dobu 15 minút.

Zložené sklíčka by sa mali skladovať chránené pred svetlom pri teplote 2 - 8 ° C.

Imunofluorescenčné farbenie

Bunky sa fixujú 4% paraformaldehydom. Ak sa majú použiť ďalšie škvrny, DAPI sa ponechá na konci ako kontrastné farbenie a bunky sa pokryjú roztokom PBS počas 15 minút. Po uplynutí času sa roztok DAPI pripraví zriedením s PBS tak, aby konečná koncentrácia bola 300 uM.

Potom sa nadbytok PBS odstráni a prekryje sa DAPI po dobu 5 minút. Niekoľkokrát sa premyje. Sklíčko sa pozoruje pod fluorescenčným mikroskopom pod príslušným filtrom.

Bezpečnostná karta

S touto zlúčeninou sa musí zaobchádzať opatrne, pretože je to zlúčenina, ktorá má mutagénne vlastnosti. Aktívne uhlie sa používa na odstránenie tejto zlúčeniny z vodných roztokov, ktoré sa majú zlikvidovať.

Aby sa predišlo nehodám s týmto činidlom, musia sa používať rukavice, plášte a ochranné okuliare. Ak dôjde ku kontaktu s pokožkou alebo sliznicou, je potrebné oblasť umyť dostatočným množstvom vody.

Toto činidlo by ste nikdy nemali pipetovať ústami, použite pipety.

Nekontaminujte činidlo mikrobiálnymi látkami, pretože to vedie k chybným výsledkom.

Farbu DAPI neriedte viac, ako sa odporúča, pretože to výrazne zníži kvalitu škvrny.

Nevystavujte reagent priamemu svetlu ani ho nevystavujte teplu, pretože to znižuje fluorescenciu.

Referencie

1. Brammer S, Toniazzo C a Poersch L. Corantes sa bežne podieľajú na cytogenetike rastlín. Arq. Inst. Biol. 2015, 82. K dispozícii od: scielo.
2. Impath Laboratories. DAPI. K dispozícii na: menarinidiagnostics.com/
3. Cytocell Laboratories. 2019. Návod na použitie DAPI. k dispozícii na cytocell.com
4. Elosegi A, Sabater S. Koncepty a techniky v ekológii riek. (2009). Editorial Rubes, Španielsko. K dispozícii na adrese: books.google.co.ve/
5. Novaes R, Penitente A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Použitie fluorescencie v modifikovanej disektorovej metóde na odhad počtu myocytov v srdcovom tkanive. Arch. Bras. Cardiol. 2012; 98 (3): 252 - 258. K dispozícii od: scielo.
6. Rojas-Martínez R., Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. Prítomnosť fytoplasiem v papáji (Carica papaya) v Mexiku. Chapingo Magazine. Záhradnícka séria, 2011; 17 (1), 47 - 50. K dispozícii na: scielo.org.