TSI AGAR: ZDÔVODNENIE, PRÍPRAVA A POUŽITIE - BIOLÓGIE - 2026

Agar TSI alebo trojité agar cukor železo je pevné médium, ktoré slúžia ako je biochemický test viesť počiatočnej identifikácii Gram negatívne bacily. Je založená na preukázaní fermentácie prítomných cukrov a výroby sírovodíka a plynu.

Jeho zloženie a základ sú veľmi podobné testu s Kliglerovým železom, s tým rozdielom, že tento obsahuje iba glukózu a laktózu. Namiesto toho, ako už názov napovedá, obsahuje trojitý cukor-železný agar tri fermentovateľné uhľohydráty: glukózu, laktózu a sacharózu.

Obrázky skúšky TSI s rôznymi mikroorganizmami A. Escherichia coli, B. Shigella flexneri, C) Salmonella typhimurium, D. Pseudomonas aeruginosa. Zdroj: Witmadrid, z Wikimedia Commons

Okrem toho má TSI médium štyri proteínové deriváty, vďaka ktorým je veľmi výživný agar: kvasnicový extrakt, mäsový extrakt, peptón a proteózový peptón. Obsahuje tiež síran železnatý, tiosíran sodný, chlorid sodný, fenolovú červenú a agar.

Neschopnosť mikroorganizmu fermentovať glukózu prítomnú v médiu ju okamžite vylučuje z toho, že patrí do čeľade Enterobacteriaceae. Tento test je preto nevyhnutný pri rozhodovaní, ktorá identifikačná cesta sa použije na určenie rodu a druhu.

Každé laboratórium sa rozhodne, či bude pracovať s TSI agarom alebo železným agarom Kliglera.

základ

Každá zo zlúčenín plní funkciu v médiu.

Chlorid sodný a agar

Chlorid sodný je potrebný na udržanie osmotickej rovnováhy média. Kým agar dáva pevnú konzistenciu.

Indikátor PH (fenolová červená)

PH pripraveného média je vyvážené na 7,3 a indikátor pH (fenolová červená) zožltne pod 6,8. To znamená, že malé množstvo kyselín produkovaných fermentáciou cukrov zmení médium z červenooranžovej na žltú.

Ak nedôjde k fermentácii, dôjde k alkalizácii média pomocou melónov, z červenooranžovej na silnú červenú.

Bielkovinové deriváty (kvasnicový extrakt, mäsový extrakt, peptón a proteózový peptón)

Keď baktérie metabolizujú proteíny prítomné v agare TSI, vznikajú amíny, ktoré alkalizujú médium (hlavne na úrovni skosenia), pretože reakcia vyžaduje kyslík. Amíny zafarbujú rám jasne na červenú.

Ale to bude závisieť od schopnosti baktérií fermentovať alebo nie.

Fermentácia uhľohydrátov (glukóza, laktóza a sacharóza)

Štúdium fermentácie cukrov môže poskytnúť niekoľko obrázkov a každý z nich je interpretovaný odlišne. Interpretácia testu rozdeľuje mikroorganizmy do 3 kategórií: nefermentátory glukózy, nefermentanty laktózy a fermentory laktóza / sacharóza.

Je potrebné poznamenať, že množstvo glukózy v médiu je obmedzené, zatiaľ čo koncentrácia laktózy a sacharózy je 10-krát vyššia.

Baktérie rodiny Enterobacteriaceae a ďalšie mikroorganizmy fermentujúce glukózu začnú fermentovať tento cukor, pretože ide o najjednoduchší energetický sacharid.

Na druhej strane, laktóza a sacharóza sú komplexné uhľohydráty, ktoré sa musia rozložiť a premeniť na glukózu, aby mohli vstúpiť do cyklu Embden-Meyerhof.

- Mikroorganizmy nefermentujúce glukózu

Ak naočkovaný mikroorganizmus nie je schopný fermentovať glukózu, oveľa menej bude schopný fermentovať iné uhľohydráty. Preto sa tu netvoria žiadne kyseliny, ale v skosení sa pomocou peptonov vytvára amín.

V tomto prípade sa rám zmení na silnejšiu červenú a spodná časť trubice môže zostať nezmenená alebo môže byť tiež alkalizovaná, pričom celá trubica zostane červená.

Výklad: K / K znamená zásadité skosenie / zásadité alebo neutrálne dno

Na obrázku na začiatku článku nájdete obrázok skúmavky D.

Tento výsledok naznačuje, že mikroorganizmus nepatrí do čeľade Enterobacteriaceae.

- Mikroorganizmy nefermentujúce laktózu / sacharózu

Ak sú baktérie schopné fermentovať glukózu, ale nie laktózu alebo sacharózu, stane sa toto:

Baktérie spotrebujú všetku prítomnú glukózu približne po 6 až 8 hodinách, pričom budú schopné okysliť skosenie aj blok; to znamená, že agar bude úplne žltý. Ale keď je vyčerpaná glukóza a nie je možné použiť laktózu a sacharózu, baktérie začnú metabolizmus proteínov.

Táto reakcia vyžaduje kyslík, preto dochádza k degradácii peptonov na povrchu (skosenie). Vytvorené amíny alkalizujú rámček zo žltého na červený. Táto reakcia je preukázaná po 18 až 24 hodinách inkubácie.

Interpretácia: K / A znamená zásadité skosenie a kyslé brodenie.

Na obrázku na začiatku článku nájdete obrázok skúmavky B.

- Mikroorganizmy fermentujúce laktózu / sacharózu

Mikroorganizmy schopné fermentovať laktózu a sacharózu môžu samozrejme fermentovať glukózu. Po vyčerpaní minimálneho množstva glukózy v médiu sa vytvorený pyruvát začne metabolizovať za vzniku kyselín cez aeróbny Krebsov cyklus a v období 8 až 12 hodín bude celé médium žlté.

Ak sú baktérie schopné odbúravať laktózu alebo sacharózu, kyseliny sa budú naďalej vyrábať a po 18 až 24 hodinách bude celá skúmavka - skosená a zátka - aj naďalej žltá.

Malo by sa poznamenať, že použitie glukózy sa uskutočňuje dvoma spôsobmi: jeden aeróbne na skosení trubice a druhý anaeróbne na spodku trubice.

Interpretácia: A / A znamená kyslé skosenie / kyslé dno. Môže alebo nemusí mať plyn.

Na obrázku na začiatku článku nájdete obrázok skúmavky A.

Výroba plynu

Niektoré mikroorganizmy sú schopné produkovať plyn počas fermentácie cukrov. Plyn je dokázaný v skúmavke tlakom, ktorý pôsobí v agare. Tlak spôsobuje tvorbu bublín alebo posun agaru. Niekedy môže tvorba plynu zlomiť médium.

Je dôležité, aby sa pri očkovaní média TSI prepichnutie robilo čisto cez stred agaru, až kým nedosiahne dno. Ak je prepichnutie odklonené smerom k stenám rúrky, môže to spôsobiť falošné pocity pri výrobe plynu, pretože bude unikať nesprávne vytvoreným kanálom.

Produkcia plynu, ako aj reakcie, ktoré sa vyskytujú v skosení agaru, vyžadujú kyslík, preto sa odporúča, aby bola skúmavka zakrytá bavlnenou zátkou, a ak sa použije viečko Bakelite, nemalo by byť úplne tesné.

Produkcia plynu sa vykazuje ako kladná (+) alebo záporná (-).

Formy tvorby plynu. Zdroj: Schéma vypracovaná MSc. Marielsa Gil. Zdroj obrázka: VeeDunnFlickr.com/Y_tambe, pomocou Wikimedia Commons

Tiosíran sodný a síran železnatý amónny

Baktérie schopné produkovať sírovodík (bezfarebný plyn) absorbujú síru z tiosíranu sodného prítomného v médiu. Akonáhle H ₂ je vytvorený S, reaguje so síranom železnatým amónnym, produkovať pyrit (jasne viditeľné čierne zrazeniny).

H ₂ výroba S je označená ako pozitívna (+) alebo negatívna (-).

Na obrázku na začiatku článku nájdete obrázok trubice C.

príprava

Navážte 62,5 g média dehydratovaného trojitého agaru na báze železného cukru (TSI) a rozpustite v jednom litri destilovanej vody.

Zahrievajte, kým sa agar úplne nerozpustí. Varte jednu minútu a často miešajte. Rozdeľte 4 ml média do 13/100 skúmaviek s vatovými viečkami.

Sterilizuje sa v autokláve pri 121 ° C počas 15 minút. Vyberte z autoklávu a nechajte ho v uhle. Je potrebné dbať na to, aby základňa aj rám boli v rovnakej vzdialenosti.

Uchovávajte v chladničke pri teplote 2-8 ° C. Pred výsevom bakteriálneho kmeňa ho nechajte zahriať.

Farba dehydratovaného média je svetlo béžová a pripravené médium je červenooranžové.

Konečné pH pripraveného média je 7,3 ± 0,2.

aplikácia

Skúška TSI sa široko používa na úrovni mikrobiologických laboratórií. Tento test je nevyhnutný na usmernenie typu testu, ktorý sa musí použiť na identifikáciu rodu a druhu. Jeho dobré prevedenie a interpretácia môže ušetriť materiál a prácu.

Ak je výsledkom TSI K / K a test cytochróm oxidázy je pozitívny, je známe, že by sa mali použiť testy na identifikáciu nefermentujúcich gramnegatívnych tyčiniek, ako sú Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Burkholderia, okrem iných rodov. Ak je oxidáza negatívna, je orientovaná na rody Acinetobacter, Stenotrophomonas atď.

Na druhej strane, ak sa získa TSI A / A alebo K / A a test cytochróm oxidázy je negatívny, čím viac dusičnanov sa redukuje na dusitany, budeme si istí, že ide o mikroorganizmus patriaci do čeľade Enterobacteriaceae. V tomto prípade sa identifikačná cesta zameria na konkrétne testy pre túto skupinu baktérií.

Na druhej strane, ak sa získa obraz K / A alebo A / A a test cytochróm oxidázy je pozitívny, ďalšie testy, ktoré sa majú zostaviť, budú zamerané na identifikáciu fermentujúcich kmeňov, ktoré nepatria do rodiny Enterobacteriaceae, ako sú: Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio a Pasteurella.

Identifikácia nasledujúcich rodov čeľade Enterobacteriaceae povedie TSI s obsahom sírovodíka, oxidáza negatívna: Proteus, Citrobacter, Edwardsiella, Leminorella, Pragia, Trabusiella alebo Salmonella.

TSI vzťahujúce sa s malou alebo stredne sírovodíka v alkalickom skosenie alkalickým pozadia a pozitívne oxidázy bude riadiť použitie testov pre identifikáciu nefermentujúce H ₂ S- produkujúcich Gram-negatívne tyčinky, ako sú Shewanella putrefaciens.

Nakoniec sa TSI môže použiť na skúmanie výroby sírovodíka v grampozitívnych baciloch, najmä ak existuje podozrenie na Erysipelothrix rhusiopathiae.

osiatych

Médium TSI musí byť naočkované čistými kolóniami, izolované v primárnych alebo selektívnych kultúrach. Ak je kolónia odobratá zo selektívnych médií, ktoré boli naočkované vzorkami so zmiešanou flórou, je potrebné dbať na to, aby sa odoberali iba z povrchu, pretože v spodnej časti kolónie sa môžu vyskytovať životaschopné kmene inhibované v tomto médiu.

Slučka by sa preto nikdy nemala ochladiť na selektívnom médiu a kolónia sa potom vyberie a naočkuje sa médiom TSI.

Výsev sa uskutoční pomocou priamej slučky alebo ihly. Urobí sa punkcia, pričom sa musí dbať na to, aby prechádzala stredom stredu, až kým nedosiahne dno, a potom sa výsev dokončí naočkovaním povrchu v kľukatom tvare. Nerobte dve vpichy.

Inkubujte pri aeróze pri 37 ° C počas 18 - 24 hodín. Tlmočiť v tomto čase, ani predtým, ani po ňom.

obmedzenia

Skúška TSI by sa mala odpočítať do 18 až 24 hodín od inkubácie. Odčítanie pred týmto časom môže byť falošne pozitívne na fermentáciu A / A. Keďže odčítanie po tomto čase môže viesť k falošne negatívnemu obrazu nefermentátora, kvôli konzumácii peptonov, ktoré alkalizujú médium.

Referencie

1. Mac Faddin J. (2003). Biochemické testy na identifikáciu baktérií klinického významu. 3. vydanie. Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentína.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentína.
3. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vydanie. Editorial Panamericana SA Argentína.
4. „TSI agar.“ Wikipedia, slobodná encyklopédia. 10. júla 2018, 08:09 UTC. 10 február 2019, 03:33 K dispozícii na adrese: es.wikipedia.org
5. Britannia Laboratories. Agar TSI (trojitý agar z cukru a železa). 2015.K dispozícii na: britanialab.com
6. Laboratóriá BD. Trojitý agar zo železného cukru (TSI Agar). 2003. K dispozícii na: bd.com