Agar TCBS je prostriedkom vysoko selektívny a diferenciálnej pevné kultúry, ktoré sa používajú na izoláciu a kultiváciu baktérií rodu Vibrio, najmä Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus a V. vulnificus ako hlavný pôvodcovia tohto druhu.
Skratka TCBS je skratka pre tiosulfát citrát žlčovej sacharózy. Tento agar je tiež známy ako selektívne médium pre Vibrios. Pôvodný vzorec bol vytvorený Nakanishim a neskôr modifikovaný Kobayashim.
Komerčné médium TCBS a platňa s agarom TCBS naočkované Vibrio cholerae. Zdroj: fotografia 1: zhotovené autorom MSc. Marielsa Gil / Foto 2: Microrao, JJMMC, Davangere, Karnataka, India
Skladá sa z kvasnicového extraktu, mäsového peptónu, tripteínu, citranu sodného, tiosíranu sodného, oxej žlče, sacharózy, chloridu sodného, citranu železitého, brómtymolovej modrej, tymolovej modrej a agaru.
Toto zloženie umožňuje primeraný vývoj druhov Vibrio zo vzoriek vody, potravy a výkalov; s výnimkou Vibrio hollisae, ktorý na tomto médiu nerastie. Médium TCBS je navyše schopné inhibovať rast ďalších sprievodných baktérií, najmä koliformných baktérií.
Vzhľadom na vážne gastrointestinálne a intestinálne problémy spôsobené niektorými druhmi rodu Vibrio je jej diagnostika veľmi dôležitá. Ľudia sú infikovaní hlavne konzumáciou surových alebo nedostatočne tepelne spracovaných potravín z mora alebo znečistenej vody, ale aj infekciou rán.
Z tohto dôvodu musia klinické laboratóriá zahrnúť TCBS agar do štúdie kultivácie stolice kvapalných vzoriek stolice, najmä s výskytom ryžovej vody. Najmä ak pacient hlási, že bol v kontakte s morskou vodou alebo že konzumoval mäkkýše alebo ryby.
základ
Výťažok z kvasníc, mäsové melóny a tripteín sú zdrojom výživy tohto média. Agar TCBS je však pre väčšinu baktérií nehostinné médium.
Jeho vysoká selektivita je daná pridaním citranu sodného a oxímovej žlče; obidve sú inhibičné činidlá, ktoré tiež poskytujú médiu zásadité pH, obmedzujú rast sprievodnej flóry a podporujú rast V. cholerae, medzi inými druhmi. Je potrebné poznamenať, že Vibrio cholerae je veľmi citlivý na kyslosť.
Chlorid sodný osmoticky vyvažuje médium. Navyše, keď je jeho koncentrácia vysoká, pôsobí tiež ako inhibičné činidlo, ktoré podporuje rast halofilných baktérií.
Sacharóza je fermentovateľný cukor, ktorý spolu s indikátormi pH brómtymolovej a tymolovej modrej dávajú médiu jeho odlišný charakter. Z tohto dôvodu je možné pomocou tohto média rozlíšiť kmene fermentujúce sacharózu od kmeňov nefermentujúcich.
Kolónie kmeňov fermentujúcich sacharózu sa vyvíjajú žltej farby a vďaka produkcii kyselín zmení médium zo zelenej na žltú. Nefermentanty rastú priesvitné a médium zostáva v pôvodnej farbe (zelená).
Rovnako toto médium obsahuje tiosíran sodný ako zdroj síry a citrát železitý ako vyvíjacie činidlo. Obidve vykazujú baktérie schopné produkovať sírovodík (bezfarebný plyn). H 2 S je vytvorený z tiosíran a následne po reakcii s citrátom železitým viditeľným čierna zrazenina.
Nakoniec agar poskytuje médiu pevnú konzistenciu.
príprava
Odváži sa 89 g dehydratovaného média a rozpustí sa v jednom litri destilovanej vody. Pomôžte rozpusteniu zahriatím a častým miešaním. Zmes sa môže variť až 2 minúty.
Toto médium nie je autoklávované. Po rozpustení sa podáva priamo na sterilné doštičky. Keď stuhnú, sú usporiadané obrátene na doštičkách a až do použitia sa uchovávajú v chladničke (2 - 8 ° C).
Médium po príprave musí zostať pri pH 8,6 ± 0,2.
Farba dehydratovaného média je svetlo béžová alebo zelenkavo-béžová a farba média je zelená alebo modrozelená.
Pred naočkovaním vzoriek je dôležité nechať platničky zahriať sa.
použitie
Najbežnejšou vzorkou na izoláciu Vibrios je hnačková stolica.
Vzorky stolice, ak nemôžu byť okamžite naočkované na selektívne médium, by sa mali prepravovať na médiu Cary Blair.
Aby sa zvýšila citlivosť kultúry, výkaly môžu prechádzať peptónovou vodou pri pH 8,4 ako obohacovacie médium po dobu maximálne 8 hodín, odtiaľ sa subkultivujú do média TCBS.
Musí sa tiež vziať do úvahy, že niektoré kmene Vibrios môžu u pacientov s imunosupresiou spôsobiť septikémiu, a preto sa môžu izolovať z krvných kultúr. Podobne je možné analyzovať vzorky vody a potravy z mora, keď sa vyskytnú epidémie cholery.
osiatych
Inokulum testovanej vzorky musí byť výrazné, siatie sa vykonáva pomocou pruhovacej metódy vyčerpaním. Doštičky sa inkubujú pri aerobióze pri 37 ° C počas 24 hodín.
Predpokladané kolónie Vibrio cholerae sú stredne veľké, hladké, nepriehľadné, s tenkými okrajmi a žltou farbou v dôsledku fermentácie sacharózy.
Druh V. alginolyticus, V. fluvialis, V. hareyi, V. cincinnatiensis, V. furnissii, V. metschnikovii a niektoré V. vulnificus rastú podobným spôsobom. Iné klinicky dôležité druhy Vibrios, ako napríklad V. parahaemolyticus, nekvasia sacharózu, vyvíjajú sa ako olivovo zelené kolónie.
Doštička s agarom TCBS naočkovaná Vibrio parahaemolyticus. Zdroj: isis325 Flickr
Na druhej strane treba mať na pamäti, že niektoré kmene Aeromonas a Plesiomonas, ktoré sú oxidázou (+), môžu v tomto médiu rásť a vytvárať žlté kolónie, ktoré môžu lekára zmiasť. Zatiaľ čo niektoré kmene Pseudomonas tiež oxidáza (+) rastú ako zelené kolónie ako V. parahaemolyticus.
obmedzenia
Test oxidázy, ktorý je pozitívny pre rod Vibrio, by sa nikdy nemal vykonávať z kolónií získaných z agaru TCBS, pretože získaný výsledok bude falošne negatívny. Zlúčeniny v strede silne zasahujú do tohto testu. Preto musí byť vyrobený zo subkultúr na krvnom agare.
QA
Aby sa dokázalo, že médium je v dobrom stave, je vhodné vysiať známe alebo certifikované kontrolné kmene a pozorovať, či rast spĺňa očakávané charakteristiky.
Na tento účel môžete použiť kmene:
-Vibrio cholerae - uspokojivý rast (žlté kolónie, priesvitná hranica).
-Vibrio parahaemolyticus - - uspokojivý rast (kolónia so zeleným stredom a priesvitná hranica).
-Vibrio alginolyticus ATCC 17749 - uspokojivý rast (žlté kolónie s halogénmi rovnakej farby okolo kolónie).
-Enterococcus faecalis ATCC 29212 - celková alebo čiastočná inhibícia (malé žlté alebo priesvitné kolónie).
-Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853-– čiastočná alebo úplná inhibícia (modré kolónie).
-Escherichia coli ATCC 25922 - Úplne inhibovaná.
-Proteus mirabilis ATCC 43071 -– Úplná alebo čiastočná inhibícia. (Priesvitné okraje zeleného centra malých kolónií).
Inkubácia naočkovaného média by sa nemala meniť.
Referencie
- Difco Francisco Soria Melguizo Laboratories. Agar TCBS. 2009. Dostupné na: f-soria.es
- Laboratórium BD. BD. TCBS Agar 2003.K dispozícii na: bd.com
- Britannia Laboratories. TCBS Medium. 2015.K dispozícii na: britanialab.com
- Acumedia Laboratories. Agar TCBS. 2016. K dispozícii na adrese: foodsafety.neogen.com
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentína.
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vydanie. Editorial Panamericana SA Argentína.