KRVNÝ AGAR: ODÔVODNENIE, POUŽITIE A PRÍPRAVA - BIOLÓGIE

Krvný agar je pevné kultivačné médium obohatené rozdiel, ale neselektívne. Používa sa na regeneráciu a rast veľkého množstva mikroorganizmov z klinických vzoriek alebo pre subkultúry.

Na očkovanie väčšiny klinických vzoriek, ktoré sa dostali do laboratória, by sa mal zahrnúť klasický krvný agar; s výnimkou vzoriek stolice, ak to nie je užitočné, pokiaľ nie sú pripravené s určitými úpravami.

Doštička na krvný agar

Toto kultivačné médium v podstate pozostáva z obohateného základného agaru a 5% krvi. Báza agaru sa môže meniť podľa potreby, ale bude pozostávať najmä z peptonov, aminokyselín, vitamínov, mäsového extraktu, chloridu sodného, agaru.

Pokiaľ ide o krv, zvyčajne sa vyžaduje kontakt s viváriom, aby sa získala krv zo zvierat, ako sú ovce, králiky alebo kone. Nie je to však vždy možné a niekedy sa používa ľudská krv.

Médium na krvný agar sa môže pripraviť v laboratóriu alebo sa dá kúpiť v hotovom obchode od špecializovaných spoločností. Príprava tohto média je jednou z najcitlivejších, akákoľvek nedbanlivosť pri jeho príprave bude mať za následok kontaminovanú dávku.

Preto sa musia prijať všetky možné preventívne opatrenia a na konci sa musí vykonať kontrola kvality inkubáciou doštičky pri 37 ° C 1 na každých 100 pripravených vzoriek.

základ

Staphylococcus aureus kultivovaný na krvnom agare. Čítanie Nathana na Flickri Nathan R. na Twitteri, prostredníctvom Wikimedia Commons Už bolo spomenuté, že krvný agar má charakter obohateného, diferencovaného a neselektívneho média. Základ pre každú z týchto vlastností je vysvetlený nižšie.

Krvný agar je obohatené médium, pretože obsahuje 5 až 10% krvi na báze agaru ako svoju hlavnú prísadu. Obe zlúčeniny obsahujú veľa výživných látok a táto vlastnosť umožňuje v nej pestovať väčšinu kultivovateľných baktérií.

K tomuto rastu dochádza bez obmedzenia; z tohto dôvodu nie je selektívny. Ak sa však do tohto média pridajú zlúčeniny, ktoré bránia rastu niektorých mikroorganizmov a uprednostňujú iné, stáva sa selektívnymi. To je prípad, keď sa pridajú určité druhy antibiotík alebo fungicídov.

Podobne je krvný agar diferenciálnym médiom, pretože umožňuje rozlíšiť 3 typy baktérií: beta-hemolytické, alfa-hemolytické a gama-hemolytické.

Beta-hemolytiká sú tie, ktoré majú schopnosť úplne lýzovať alebo odbúravať červené krvinky a okolo kolónií vytvárajú číry halo, preto produkujú ß alebo ß-hemolýzu a mikroorganizmy sa nazývajú ß-hemolytické.

Príklady ß-hemolytických baktérií sú Streptococcus pyogenes a Streptococcus agalactiae.

Alfa-hemolytiká sú tie, ktoré vykonávajú čiastočnú hemolýzu, kde sa hemoglobín oxiduje na methemoglobín, čím sa okolo kolónií vytvára zelenkavé sfarbenie. Tento jav je známy ako α alebo α-hemolýza a baktérie sú klasifikované ako α - hemolytické.

Príklady a-hemolytických baktérií sú Streptococcus pneumoniae a Streptococcus skupiny viridans.

Nakoniec existujú tzv. Gama-hemolytické alebo nehemolytické baktérie. Rastú na agare bez toho, aby na tom vyvolali zmeny, čo je efekt známy ako y -hemolýza a mikroorganizmy sú y -hemolytické.

Príklad y-hemolytických baktérií: niektoré kmene skupiny D Streptococcus (Streptococcus bovis a Enterococcus faecalis).

aplikácia

Kultivačné médium na krvný agar je jedným z najbežnejšie používaných v mikrobiologickom laboratóriu.

Medzi mikroorganizmy schopné rásť v krvnom agarovom médiu patria: prísne aeróbne, fakultatívne, mikroaerofilné, anaeróbne, grampozitívne alebo gramnegatívne baktérie, rýchlo rastúce alebo pomaly rastúce baktérie.

Rastú tiež niektoré výživovo náročné alebo náročné baktérie, ako aj huby a kvasinky. Podobne je užitočný na subkultiváciu alebo reaktiváciu kmeňov, ktoré sú metabolicky veľmi slabé.

Výber krvného typu a základného agaru sa však bude líšiť v závislosti od pravdepodobného mikroorganizmu, u ktorého existuje podozrenie na regeneráciu, a od použitia, na ktoré sa má doska použiť (kultúra alebo antibiogram).

Výber krvného typu

Krv môže byť jahňacie, králičie, konské alebo ľudské.

Najviac odporúčaná je krv jahniat, až na niekoľko výnimiek. Napríklad na izoláciu druhov Haemophilus, kde odporúčanou krvou je koňská alebo králičia krv, pretože jahňacia krv obsahuje enzýmy, ktoré inhibujú faktor V.

Najmenej odporúčaný je človek, je však najpoužívanejší, možno preto, že je najľahší ho získať.

Krv sa musí defibrinovať, musí sa získať bez akýchkoľvek doplnkových látok a od zdravých zvierat. Pri použití ľudskej krvi je potrebné zohľadniť niekoľko faktorov:

Ak krv pochádza od jedincov, ktorí mali bakteriálne infekcie, budú mať špecifické protilátky. Za týchto podmienok je pravdepodobné, že rast niektorých baktérií bude inhibovaný.

Ak sa získa z krvnej banky, obsahuje citrát a určité baktérie nemusia v prítomnosti rásť. Na druhej strane, ak krv pochádza od pacientov, ktorí užívajú antibiotiká, rast citlivých baktérií môže byť inhibovaný.

A ak je krv od diabetika, nadbytok glukózy interferuje so správnym vývojom hemolytických schém.

Výber typu základného agaru

Základný agar používaný na prípravu krvného agaru môže byť veľmi široký. Medzi ne patrí: živný agar, agar s infúziou srdca, tryptikáza, sójový agar, Müeller Hintonový agar, Thayer Martinov agar, Columbia agar, Brucella agar, Campylobacter agar atď.

Použitie krvného agaru podľa základného média použitého na jeho prípravu

Živný agar

Táto báza je najmenej využívaná, pretože bude rásť najmä nenáročné baktérie, ako sú napríklad enterické bacily, Pseudomonas sp, S. aureus, Bacillus sp. Neodporúča sa izolovať Streptococcus.

Agar s infúziou srdca (BHI)

Je to jedna z najčastejšie používaných ako základ pre krvný agar, pretože obsahuje potrebné živiny pre rast väčšiny baktérií, vrátane Streptococcus sp a ďalších náročných baktérií. Aj keď nie je vhodné pozorovať hemolýzu.

S touto základňou sa všeobecne používa jahňacia krv.

Môžu sa pripraviť aj varianty krvného agaru, kde sa pridajú ďalšie zlúčeniny na izoláciu určitých mikroorganizmov. Napríklad mozgový infúzny agar doplnený králičou krvou, cystínom a glukózou sa môže použiť na izoláciu Francisella tularensis.

Zatiaľ čo s cystín telluritom je užitočný na izoláciu Corynebacterium diphteriae. Môže sa použiť ľudská alebo jahňacia krv.

Pri prvej beta-hemolýze bude vidieť úzky halo, zatiaľ čo pri druhom bude halo oveľa širšie.

Podobne sa táto báza spolu s bacitracínom, kukuričným škrobom, konskou krvou a ďalšími doplnkami na obohacovanie (IsoVitaleX) používa na izoláciu rodu Haemophilus sp zo vzoriek dýchacích ciest.

Ak sa tiež pridá kombinácia antibiotík chlóramfenikol - gentamicín alebo penicilín - streptomycín s konskou krvou, je ideálna na izoláciu náročných patogénnych húb, dokonca aj s vyšším výťažkom ako glukózový agar Sabouraud. Je zvlášť užitočný pri izolácii Histoplasma capsulatum.

Tryptikázový sójový agar

Táto báza je najviac odporúčaná na lepšie pozorovanie hemolytického profilu a na vykonávanie diagnostických testov, ako sú taxóny optoquínu a bacitracín. Rutinne sa používa klasický krvný agar.

S touto základňou môžete tiež pripraviť špeciálny krvný agar pre Corynebacterium diphteriae, s cystínovým teluritom a jahňacej krvi .

Podobne je kombinácia tohto agaru s jahňacou krvou a kanamycín-vankomycínom ideálna pre rast anaeróbov, najmä Bacteroides sp.

Müeller Hintonový agar

Táto báza doplnená krvou sa používa na vykonávanie antibiogramu náročných mikroorganizmov, ako je napríklad Streptococcus sp.

Je tiež užitočný na izoláciu baktérií, ako je Legionella pneumophila.

Thayer Martin Agar

Toto médium je ideálne ako základ pre krvný agar pri podozrení na rod Neisseria, najmä na Neisseria meningitidis, pretože N. gonorrhoeae nerastie na krvnom agare.

Používa sa tiež na testovanie citlivosti na Neisseria meningitidis.

Agar Columbia

Táto báza je vynikajúca na očkovanie vzoriek biopsie žalúdka na Helicobacter pylori.

Médium sa pripravuje pridaním 7% jahňacej krvi defibrinovanej antibiotikami (vankomycín, trimetoprim, amfotericín B a cefsulodín), aby sa obmedzil rast ďalších prítomných baktérií.

Rovnaká báza doplnená ľudskou alebo jahňacou krvou, kyselinou nalidixovou a kolistínom je užitočná na izoláciu Gardnerella vaginalis. Je tiež ideálny na hodnotenie antimikrobiálnej citlivosti na antibiotiká toho istého mikroorganizmu.

Okrem toho sa používa na prípravu krvného agaru na kultiváciu anaerobov, pridávanie aminoglykozidov a vankomycínu.

Táto báza umožňuje správne pozorovanie hemolytických schém.

Brucella agar

Toto médium používané ako základ pre krvný agar spolu s prídavkom vitamínu K je ideálne na kultiváciu anaeróbnych baktérií. V takom prípade sa odporúča použiť jahňaciu krv.

Agar Campylobacter

Agar Campylobacter doplnený 5% ovčej krvi a 5 antibiotikami (cefaloteín, amfotericín B, trimethoprim, polymyxín B a vankomycín) je médium používané na izoláciu Campylobacter jejuni vo vzorkách stolice.

príprava

Každý komerčný dom prináša pokyny na prípravu litra kultivačného média na zadnej strane nádoby. Zodpovedajúce výpočty sa môžu urobiť na prípravu požadovaného množstva v závislosti od vybraného základného agaru.

Odvážte a rozpustite

Základný agar je dehydratovaný (prášok), preto musí byť rozpustený v destilovanej vode upravenej na pH 7,3.

Množstvo označené zvoleným základným agarom sa odváži a rozpustí sa v zodpovedajúcom množstve vody v banke, potom sa zahrieva na mierny ohrev a mieša sa rotačnými pohybmi, až kým sa všetok prášok nerozpustí.

sterilizuje

Po rozpustení sterilizujte v autokláve pri 121 ° C po dobu 20 minút.

Krvný agregát

Pri opúšťaní autoklávu sa banka nechá vychladnúť, kým sa teplota pohybuje v rozmedzí od 40 do 50 ° C; Je to teplota, ktorú ľudská pokožka podporuje, a zároveň agar ešte nestuhol.

Za týmto účelom sa liekovka dotkne rukou a ak je teplo tolerovateľné, je ideálnou teplotou pridať zodpovedajúce množstvo defibrinovanej krvi (50 ml na každý liter agaru). Jemne premiešajte, aby sa homogenizovala.

Prechod agregácie krvi je rozhodujúci, pretože ak sa tak stane, keď je médium veľmi horúce, červené krvinky sa rozkladajú a médium sa nebude používať na pozorovanie hemolýzy.

Ak sa pridá príliš chladno, zhlukne sa a povrch média nebude hladký, aby sa umožnilo správne hodnotenie.

Nalejte do Petriho misky

Podávajte v sterilných Petriho miskách ihneď po homogenizácii krvi. Do každej Petriho misky sa naleje približne 20 ml. Tento postup sa vykonáva v laminárnom digestore alebo v blízkosti horáka.

Pri podávaní krvného agaru v Petriho miskách by na povrchu doštičky nemali zostať žiadne vzduchové bubliny. Ak k tomu dôjde, plameň Bunsenovho horáka prechádza rýchlo cez dosku, aby sa odstránil.

Doštičky sa nechajú stuhnúť a až do použitia sa uchovávajú v chladničke pri teplote 2 až 8 ° C. Pred použitím doštičiek na krvný agar sa musia temperovať (nechať dosiahnuť izbovú teplotu), aby sa mohli naočkovať.

Pripravené platne trvajú približne 1 týždeň.

Referencie

Bayona M. Mikrobiologické podmienky pre kultiváciu Helicobacter pylori. Rev Col Gastroenterol 2013; 28 (2): 94-99
García P, Paredes F, Fernández del Barrio M. (1994). Praktická klinická mikrobiológia. University of Cadiz, 2. vydanie. UCA Publications Service.
"Krvný agar." Wikipedia, slobodná encyklopédia. 10. decembra 2018, 14:55 UTC. 27. decembra 2018, 01:49 en.wikipedia.org.
Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Argentína. Editorial Panamericana SA
Laboratórne veterinárne diagnostické centrum CEDIVET. Guatemala. K dispozícii na adrese: trensa.com.
Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. (5. vydanie). Argentina, Editorial Panamericana SA

KRVNÝ AGAR: ODÔVODNENIE, POUŽITIE A PRÍPRAVA - BIOLÓGIE - 2026