SABOURAUDOV AGAR: ZALOŽENIE, PRÍPRAVA A POUŽITIE - BIOLÓGIE - 2026

Agaru Sabouraud , tiež známy ako Sabouraud dextrózový agar, je pevný prostriedok, najmä obohatené pre izoláciu a rozvoj plesní, ako sú napríklad kvasinky, plesne a dermatofyty.

Preto toto médium nemôže chýbať v mikrobiologickom laboratóriu na vyšetrenie prítomnosti patogénnych alebo oportúnnych húb, či už z klinických alebo neklinických vzoriek. Rovnako je tiež ideálny pre rast vláknitých baktérií, ako sú Streptomyces a Nocardias. Jeho použitie je veľmi široké, pretože sa dá použiť v humánnej, živočíšnej, rastlinnej a priemyselnej mykológii.

A. Neviditeľný agar Sabouraud. Agar B. Sabouraud vysiaty kvasinkami. Zdroj: Fotografie zhotovené autorom MSc. Marielsa gil

Toto médium vytvoril v roku 1896 prominentný dermatológ Raimond Sabouraud, ktorý sa stal svetovo uznávaným špecialistom na poruchy pokožky hlavy, spôsobené hlavne dermatofytmi.

Jeho vytvorenie bolo také dôležité, že sa používa dodnes a dodnes zostáva, aj keď s určitými úpravami.

Aj keď je to špeciálne pre huby, baktérie môžu rásť v tomto médiu, a preto sa pri vzorkách so zmiešanou flórou vyžaduje zahrnutie antibiotík do ich prípravy, aby sa inhiboval rast bakteriálnej flóry, ktorá môže byť prítomná.

Pri výbere antibiotika sa musí postupovať starostlivo a musí sa brať do úvahy druh huby, ktorá sa má regenerovať, pretože niektoré sú v prítomnosti určitých látok inhibované.

základ

Agar Sabouraud dextrózy je médium, ktoré je vo svojej pôvodnej formulácii slabo selektívne vzhľadom na kyslé pH 5,6 ± 0,2, ale baktérie sa môžu stále vyvíjať, hlavne pri dlhodobých inkubáciách.

Médium obsahuje kazeínový peptón a pankreatické štiepenie živočíšneho tkaniva, ktoré poskytuje zdroj uhlíka a dusíka pre rast mikroorganizmov.

Obsahuje tiež vysokú koncentráciu glukózy, ktorá pôsobí ako zdroj energie a podporuje rast húb nad baktériami. To všetko v zmesi s agar-agarom, zložkou, ktorá mu dáva správnu konzistenciu.

Na druhej strane agar Sabouraud dextrózy môže byť selektívny, ak sa pridajú antibiotiká.

S antibiotikami je obzvlášť užitočný vo vzorkách rán, otvorených vredov alebo vo vzorkách, u ktorých existuje podozrenie na veľkú bakteriálnu kontamináciu.

Najčastejšie používané kombinácie agaru Sabouraud dextrózy s antibiotikami

-Saburaudský agar s chloramfenikolom: ideálny na regeneráciu kvasiniek a vláknitých húb.

- agar Sabouraud s gentamicínom a chloramfenikolom: v tomto médiu rastú takmer všetky vláknité huby a kvasinky a inhibuje veľké množstvo baktérií vrátane Enterobacteriaceae, Pseudomonas a Staphylococcus.

- Sabouraudský agar s cykloheximidom: je zvlášť užitočný pre vzorky z kože alebo dýchacích ciest, pokiaľ je podozrenie na dimorfné huby.

Cykloheximid by sa mal používať opatrne; Aj keď sa používa na inhibíciu rastu nepatogénnych alebo environmentálnych húb a kvasiniek, ktoré môžu byť vo vzorke prítomné ako kontaminanty, tiež inhibuje rast niektorých húb, ako sú Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Allescheria boydii, Penicillium sp a ďalšie oportunistické huby.

- Sabouraudov agar s chloramfenikolom plus cykloheximidom: používa sa hlavne na izoláciu dermatofytov a dimorfných húb. Nevýhodou je, že inhibuje niektoré druhy oportúnnych húb, ako sú Candida no albicans, Aspergillus, Zygomycetes alebo C. neoformans.

- Sabouraudov agar s chloramfenikolom, streptomycínom, penicilínom G a cykloheximidom: je ideálny pre vzorky extrémne kontaminované baktériami a saprofytickými hubami, má však tú nevýhodu, že okrem vyššie uvedených oportunistických húb inhibuje aj rast Actinomyces a Nocardias.

príprava

Ak máte ingrediencie osobitne, môžete ich pripraviť nasledovne:

Sabouraud dextrózový agar

Vážiť:

- 40 g dextrózy

- 10 g peptónu

- 15 gramov agaru

- Odmerajte 1000 ml destilovanej vody

Všetky zložky sú zmiešané, pH je upravené na 5,6. Rozpustené látky sa rozpustia varom, 20 ml média sa rozdelí do skúmaviek s rozmermi 25 x 150 mm, bez okraja a výhodne s vatovým uzáverom.

Rúry s vatovým uzáverom. Zdroj: Fotografia zhotovená autorom MSc. Marielsa gil

V závislosti od dostupnosti je možné použiť aj iné veľkosti trubíc.

Autoklávujú sa 10 minút pri tlaku (121 ° C). Čas autoklávovania by sa nemal prekročiť. Pri opúšťaní autoklávu sa skúmavky nakláňajú pomocou držiaka, až kým neztuhnú v zobáku s drážkou.

Iným spôsobom je rozpustenie ingrediencií zahrievaním, až kým sa nevarí. Autoklávujte 10 minút v tej istej liekovke a potom rozdeľte 20 ml v Petriho miskách.

Ak máte agarové médium Sabouraud s dextrózou, ktoré už obsahuje všetky zložky, pokračujte v zvážení množstva určeného obchodnou spoločnosťou na jeden liter vody. Zvyšné kroky sú rovnaké ako vyššie uvedené kroky.

Sabouraudov dextrózový agar (Emmonsova modifikácia)

Vážiť:

- 20 g dextrózy

- 10 g peptónu

- 17 g agaru

- Odmerajte 1000 ml destilovanej vody

Všetky zložky sú zmiešané, pH je upravené na 6,9. Postupujte rovnako ako v predchádzajúcom prípade.

Existujú obchodné domy, ktoré ponúkajú médium so všetkými ingredienciami. V takom prípade odvážte a pripravte postup podľa popisu na príbalovom letáku.

Sabouraud dextrózový agar (Emmonsova modifikácia) s chloramfenikolom

Zásobný roztok chloramfenikolu

- Odvážiť 500 mg chloramfenikolovej bázy

- Odmerajte 100 ml 95% etanolu

- Zmiešať

Médium s agarom Sabouraud dextróza (Emmons) sa pripraví tak, ako už bolo opísané, a navyše sa do každého litra média pred autoklávovaním pridá 10 ml zásobného roztoku chloramfenikolu.

Sabouraud Emmons dextrózový agar s cykloheximidom

Zásobný roztok cykloheximidu

- Navážte 5 g cykloheximidu

- Odmerajte 100 ml acetónu

- Zmiešať

Médium s agarom Sabouraud dextróza (Emmons) sa pripraví tak, ako už bolo opísané, a navyše sa do každého litra média pred autoklávovaním pridá 10 ml zásobného roztoku cykloheximidu.

Agar Sabouraud dextrózy (Emmons) s chloramfenikolom a cykloheximidom

Médium s agarom Sabouraud dextróza (Emmons) sa pripraví tak, ako bolo opísané vyššie, a navyše sa do každého litra média pred autoklávovaním pridá 10 ml zásobného roztoku chloramfenikolu a 10 ml zásobného roztoku cykloheximidu.

Iné antibiotiká, ktoré sa môžu pridať

20 000 až 60 000 jednotiek penicilínu na liter média.

30 mg streptomycínu na liter média.

Obidva musia byť začlenené po autoklávovaní média, mierne ochladené (50 - 55 ° C).

0,04 g neomycínu na liter média.

0,04 g gentamicínu na liter média.

Osobitné úvahy

Kvôli bezpečnosti je výhodné radiť Sabouraud dextrózový agar do skúmaviek v tvare klinu (naklonených v flaute zobáku), skôr ako do Petriho misiek, aby sa zabránilo rozptylu a inhalácii spór.

Je dôležité, aby skúmavky z agaru Sabouraud boli pokryté bavlnou, a nie skrutkovacím uzáverom, pretože sa ukázalo, že polo anaeróbne podmienky inhibujú tvorbu spór u niektorých kmeňov, napríklad Coccidioides immitis. Väčšina húb je tiež aeróbna.

V prípade použitia skrutkovacieho uzáveru hermeticky nezatvárajte.

QA

Pripravené médiá sa musia podrobiť kontrole kvality, aby sa overilo jej správne fungovanie. Za týmto účelom sa vysejú určité kontrolné kmene.

Pre agar Sabouraud dextróza s chloramfenikolom sa môžu použiť kmene Candida albicans ATCC, ktoré musia mať vynikajúci rast. Ďalšia doštička sa naočkuje kmeňmi Escherichia coli, ktoré sa musia úplne inhibovať.

Inkubuje sa tiež naočkovaná platňa, v ktorej by nemali rásť žiadne mikroorganizmy.

Pre agar Sabouraud dextróza s chloramfenikolom a cykloheximidom sa môžu použiť kmene Trichophyton mentagrophytes a mali by sa dobre rozvíjať. Ďalšia doštička sa naočkuje kmeňom Aspergillus flavus, v ktorom musí byť malý alebo žiadny rast. Okrem toho sa neinokulovaná platňa inkubuje, aby sa preukázala jej sterilita.

Pre agar Sabouraud dextrózy s cykloheximidom sa používajú kmene Candida albicans, Trichophyton rubrum alebo Microsporum canis, ktoré musia vykazovať dobrý rast.

Podobne je zahrnutý kmeň Aspergillus flavus, ktorý vykazuje malý alebo žiadny rast. Nakoniec inkubujte naočkovanú doštičku na kontrolu sterility.

aplikácia

Primárna kultúra

Klasický agar Sabouraud dextrózy obsahuje 4 gramy dextrózy a je vynikajúci ako primárne izolačné médium, pretože ukazuje charakteristickú morfológiu každej huby.

Je tiež vynikajúci na preukázanie produkcie pigmentu. Nie je to však najlepší prostriedok na pozorovanie sporulácie.

Neodporúča sa ani na kultiváciu Blastomyces dermatitidis, ktorá je inhibovaná vysokou koncentráciou prítomnej glukózy.

Na druhej strane, pri kultivácii sa musia zohľadniť určité aspekty.

Niektoré huby rastú najlepšie pri izbovej teplote, ako sú napríklad plesne, iné rastú úspešne pri 37 ° C, napríklad niektoré kvasinky, a iné môžu rásť pri obidvoch teplotách (dimorfné huby).

Z tohto dôvodu je niekedy potrebné použiť niekoľko misiek s agarom Sabouraud pre tú istú vzorku, pretože dvojité očkovanie sa často robí inkubáciou jednej misky pri izbovej teplote a druhej pri 37 ° C.

Napríklad Sporothrix schenckii sa vysieva na dve platne; jedna sa inkubuje pri teplote miestnosti, aby sa získala fáza plesne, druhá sa inkubuje pri 37 ° C, aby sa získala kvasinková fáza, ale v druhej sa musí do média pridať 5% krvi.

V iných prípadoch, ako sú napríklad vzorky mycetómu, sa naočkujú dve misky s agarom Sabouraud, jedna s chloramfenikolom a druhá s cykloheximidom. Prvá umožní rast myktomatických pôvodcov fungálneho pôvodu (Eumycetoma) a druhých pôvodcov mycetómu bakteriálneho pôvodu, ako sú aktinomycetómy.

sporuláciu

Emmons modifikovaný Sabouraud dextrózový agar obsahuje 2 gramy dextrózy a používa sa nielen na izoláciu, ale aj na sporuláciu a konzerváciu húb.

V tomto médiu je možné získať kmene Blastomyces dermatitidis.

konzervácia

Na zachovanie kultúr húb sa môžu uchovávať v chladničke (2 - 8 ° C). Čas uchovania sa môže meniť od 2 do 8 týždňov. Po uplynutí tejto doby sa musia subkultivovať, aby sa proces zopakoval.

Niektoré huby sa najlepšie udržiavajú pri izbovej teplote, napríklad Epidermophyton foccosum, Trichophyton schoenleinnii, T. violaceum a Microsporum audounii.

Udržiavanie kmeňa sa môže predĺžiť, aby sa predišlo pleomorfizmu, ak sa dextróza úplne odstráni z agaru a ak sa množstvo agaru v médiu zníži, aby sa zabránilo vysušeniu.

mikrokultúry

Na identifikáciu niektorých vláknitých húb je potrebné vykonať mikrokultúry s použitím Sabouraudovho agaru alebo inými špeciálnymi prostriedkami na pozorovanie štruktúr sexuálnej a asexuálnej reprodukcie.

V ľudskej mykológii

Používa sa hlavne na diagnostiku plesňových chorôb, najmä tých, ktoré ovplyvňujú pokožku a jej prichytenia (vlasy a nechty).

Vzorkami môžu byť sekréty, exsudáty, koža, vlasy, nechty, spútum, CSF alebo moč. Bežne izolované patogény sú dermatofyty, huby, ktoré spôsobujú subkutánne a systémové mykózy.

Mykológia zvierat

Zvieratá sú často postihnuté hubovými infekciami, a preto je agar Sabouraud rovnako užitočný v mykológii zvierat ako u ľudí.

Napríklad dermatofyty môžu často postihovať zvieratá. To je prípad Microsporum canis var distortum, ktorý často infikuje psy, mačky, kone, ošípané a opice. Podobne Microsporum gypseum infikuje psy, mačky a hospodárske zvieratá.

Vtáky, ako sú kurčatá, kohúty a kurčatá, sú postihnuté mikroorganizmom Microsporum gallinae.

Iné huby, ako napríklad Zymonema farciminosum, sú tiež príčinou chorôb u zvierat, najmä koní, mulov a somárov, ktoré spôsobujú výrazný zápal v lymfatických cievach.

Sporothrix schenkii a Histoplasma capsulatum ovplyvňujú domáce zvieratá a ľudí.

Environmentálna mykológia

Mnoho patogénnych alebo oportúnnych húb sa môže koncentrovať kedykoľvek v danom prostredí, najmä v operačných sálach a jednotkách intenzívnej starostlivosti (ICU) kliník a nemocníc. Preto je potrebné ich kontrolovať.

Ďalšími zraniteľnými priestormi sú knižnice a staré budovy, ktoré môžu byť ovplyvnené koncentráciou environmentálnych húb.

V environmentálnych štúdiách sa agar Sabouraud dextrózy používa na izoláciu húb.

Priemyselná mykológia

Agar Sabouraud dextrózy nemôže chýbať okrem iného na štúdium kontaminujúcich húb pri výrobe kozmetiky, potravín, nápojov, kože, textilu.

Rastlinná mykológia

Rastliny tiež trpia chorobami spôsobenými hubami, ktoré postihujú rôzne časti rastlín, ktoré môžu dokonca ukončiť úrodu a spôsobujú veľké straty v poľnohospodárstve.

Referencie

1. Cuenca M, Gadea I, Martín E, Pemán J, Pontón J, Rodríguez (2006). Štúdie mikrobiologickej diagnostiky mykóz a antimykotiká. Odporúčania španielskej spoločnosti pre infekčné choroby a klinickú mikrobiológiu. K dispozícii na adrese: coesant-seimc.org
2. Laboratórium ValteK. (2009). Sabouraud dextrózový agar s cykloheximidom. K dispozícii na: andinamedica.com.
3. Navarro O. (2013). Veterinárna mykológia. Národná agrárna univerzita. Nikaragua.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Argentína. Editorial Panamericana SA
5. Casas-Rincón G. Všeobecná mykológia. 1994. 2. vydanie, Central University of Venezuela, Edícia knižníc. Venezuela Caracas.