AGAR ZO ZEMIAKOVEJ DEXTRÓZY: ODÔVODNENIE, PRÍPRAVA A POUŽITIE - BIOLÓGIE - 2026

Zemiakový dextrózový agar je médium, pevný non - selektívne živné kultúry. V nich môžu rásť bakteriálne a plesňové druhy, ale jeho použitie je osobitne určené na izoláciu vláknitých húb a kvasiniek. Je známe aj ako médium PDA pre anglický výraz Potato Dextrose Agar.

Je zvlášť užitočný na izoláciu fytopatogénnych húb, to znamená tých, ktoré ovplyvňujú rastliny. Na zasiatie vzoriek z infikovanej zeleniny sa môžu použiť aj iné prostriedky, ako je Sabouraudov agar alebo malta-agar, avšak na bežné použitie sa uprednostňuje agar zo zemiakovej dextrózy, pretože sa získa väčšia sporulácia.

Aspergillus niger a Sinemas na agare zemiakovej dextrózy. Zdroj: Alextrevelian 006 na anglickej Wikipédii / Joselrojas

Používa sa tiež na počítanie plesňových kolónií vo vzorkách kozmetických výrobkov, farmaceutických výrobkov a niektorých mliečnych potravín. Rovnako je vhodný na siatie vzoriek kožných výterov pri hľadaní dermatofytov, ktoré v tomto médiu veľmi dobre rastú a vyvíjajú sa ich charakteristické pigmenty.

Médium zemiakovej dextrózy je veľmi jednoduché a ľahké médium na prípravu v laboratóriu. Obsahuje, ako už názov napovedá, infúziu zemiakov, dextrózy a agaru. Ďalej sa môžu pridať inhibičné látky, aby sa zabránilo bakteriálnemu rastu a zvýšila sa selektivita pre huby.

základ

Agar zo zemiakovej dextrózy je kultivačné médium, ktoré poskytuje výživové prvky potrebné na vývoj vláknitých húb a kvasiniek.

Kombinácia infúzie zemiakov s glukózou poskytuje dokonalý zdroj energie pre uspokojivý rast húb. Zatiaľ čo agar je ten, ktorý poskytuje konzistenciu média.

Samotné médium neinhibuje rast baktérií, preto je to neselektívne médium. Aby bol selektívny, potrebuje pridanie inhibičných látok, ako je kyselina vínna alebo antibiotiká.

príprava

- domáci (nekomerčné) príprava agaru zo zemiakovej dextrózy

Petriho misky

Pripravuje sa takto:

V prvom rade sa zemiaky umývajú veľmi dobre a odstraňujú sa nimi pôdy. Sú nakrájané na tenké plátky so všetkým a škrupinou. Odváži sa 200 gramov zemiakov a pol hodiny sa varí v litri destilovanej vody.

Na konci tejto doby všetok prípravok prefiltrujte alebo preceďte cez tenkú vrstvu.

Získaná kvapalina sa doplní destilovanou vodou do jedného litra. K infúzii sa pridá 20 g agar-agaru a 20 g dextrózy, dobre sa premieša a autoklávuje sa pri 121 ° C, pri tlaku 15 libier tlaku počas 15 minút.

Nechajte vychladnúť na 50 ° C a podávajte v sterilných Petriho miskách. Pripravené platne sa uložia do chladničky.

kliny

Môžu sa tiež pripraviť kliny s agarom zo zemiakovej dextrózy.

V tomto prípade sa pred sterilizáciou v autokláve vloží do skúmaviek 12 až 15 ml média, neskôr sa autoklávujú a pri odchode ležia na špeciálnych nosičoch, kým neztuhnú. Uchovávajte v chladničke.

Médium zostáva pri pH 5,6 ± 0,2, avšak niektoré laboratóriá pridávajú 10% kyselinu vínnu na zníženie pH na 3,1 ± 0,1, aby sa inhiboval bakteriálny rast.

V tomto zmysle iné laboratóriá uprednostňujú pridávanie antibiotík, aby boli selektívne pre pestovanie húb a zabránili množeniu baktérií.

- Komerčná príprava agaru zemiakovej dextrózy

Odváži sa 39 g komerčne dostupného dehydratovaného média a rozpustí sa v jednom litri destilovanej vody. Nechajte ho pôsobiť 5 minút.

Zmes sa zahrieva za častého miešania až do úplného rozpustenia. Následne sa sterilizuje v autokláve pri 121 ° C počas 15 minút.

Môžu sa pripraviť platne alebo kliny. Postupujte ako je uvedené vyššie.

PH zostáva na 5,6 ± 0,2. Ak sa požaduje pH 3,1, pred podaním na doštičky by sa malo pridať 14 ml sterilnej 20% kyseliny vínnej.

Surové médium je béžové a pripravené médium je svetlo jantárové s mierne zakaleným alebo opalizujúcim vzhľadom.

aplikácia

Postup výsevu vzoriek rastlín na agare zemiakovej dextrózy

-Pre zafarbené listy

Listy sa nakrájajú na kúsky.

Do 50 cm3 pohára s 50% alkoholom vložte kúsky listov (zafarbené a zdravé kúsky), aby dezinfikovali povrch na 20 až 30 sekúnd. Zlikvidujte alkohol a pridajte 20% chlórnan sodný po dobu 40 až 50 sekúnd, ak sú tenké listy, a ak je kôra a polená, zvyšte čas na 80 sekúnd.

Zlikvidujte chlórnan sodný a dezinfikované kusy odoberte pomocou sterilných klieští a umiestnite ich na povrch média (maximálne 10 kusov). Nastavte dátum a inkubujte pri 20 - 30 ° C.

- Na ovocie a hľuzy

Ak je ovocie mäsité, otvorte ovocie napadnuté hubou a rozoberte kúsky sterilným skalpelom tak z chorých, ako aj zo zdravých častí a položte ich na povrch agaru.

Ak je ovocím citrus, napríklad citrón alebo pomaranč, musí sa otvoriť a jeho semená sa musia vysiať.

Ak je povrch ovocia ovplyvnený a spozorované spóry, ideálne je použitie metódy mriežky na tanieri; Spočíva v tom, že sa spory dotknú sterilizovanou a ochladenou špachtľou v tvare „L“ a potom sa na agare 2 až 3-krát zaočkuje kľukatkou.

- Na zrná

Dezinfikujú sa, ako je opísané v listoch, a neskôr sa umiestnia na agar.

-Pre vetvy a stonky

Kôra sa odreže a neskôr sa kúsky zdravej a chorej časti odoberú a vysejú priamo na agar.

Očkované platne sa inkubujú aeróbne pri 20 - 30 ° C počas 72 hodín.

Postup na siatie vzoriek z kože, vlasov alebo nechtov na agare zemiakovej dextrózy

Odber vzoriek by sa mal vykonávať pomocou čepele skalpelu č. 11, a to buď na strihanie postihnutých vlasov, kožných šupín alebo nechtov pri hľadaní dermatofytov. Pred odobratím vzorky by mala byť oblasť dezinfikovaná 70% alkoholom.

-Každá vzorka

Pri šupinatých léziách by sa mal okraj lézie zoškrabať, pretože sa tam huby vyskytujú častejšie.

Pri exsudatívnych léziách sa vzorka odoberá suchým alebo mokrým tampónom. Ihneď zasejte na agar zo zemiakovej dextrózy alebo agaru Sabouraud. Vyhnite sa dopravným prostriedkom.

Ďalšou metódou vzorkovania je technika kobercového štvorca Mariat a Adan Campos. V tomto prípade je postihnutá oblasť trikrát potiahnutá kúskom sterilnej vlny na následnú kultiváciu.

Vzorka sa môže umiestniť priamo do kultivačného média.

- Vzorka

V závislosti od patológie môže byť postihnutá časť odrezaná alebo vykorenená. Vložte vzorku do kultivačného média.

- Vzorka na nechty

Konkrétna časť postihnutého nechtu môže byť zoškrabaná alebo odrezaná. Závisí to od typu zranenia.

Pred výsevom vzorku rozrezajte na 1 mm kúsky, aby sa zvýšila pravdepodobnosť kontaktu huby s kultivačným médiom.

Postup identifikácie

Kolónie získané v doštičke sa izolujú v skúmavkách obsahujúcich agar zo zemiakovej dextrózy, aby sa vykonalo makroskopické štúdium kolónií (vzhľad, farba, konzistencia, stupeň vývoja).

Mikroskopická štúdia (pozorovanie štruktúr a ich formácií) sa môže vykonať pomocou mikrokultúr alebo priamym pozorovaním pod mikroskopom medzi sklíčkom a sklíčkom.

Počet kolónií

Toto médium sa môže tiež použiť na stanovenie plesňového a kvasinkového zaťaženia prítomného vo vzorkách rastlín, potravín, kozmetických prípravkov alebo liečiv. Na tento účel sa používa zemiakový dextrózový agar doplnený antibiotikami, ako sú: (chloramfenikol, chlórtretracyklín alebo obidve).

Nalejte 1 ml vzorky - najlepšie nariedenej - do sterilnej a prázdnej Petriho misky, potom rozpustite vankúšik z agaru zemiakovej dextrózy a nechajte vychladnúť na 45 ° C. Nalejte na Petriho misku a otáčajte, kým sa homogenizuje. Nechajte ju odpočívať, kým neztuhne.

Inkubujte aeróbne pri 20 - 25 ° C (plesne) alebo 30 - 32 ° C (kvasinky) po dobu 5 až 7 dní alebo viac, v závislosti od typu požadovanej huby a typu vzorky. Na inkubáciu v oboch teplotných rozsahoch sa môžu použiť dve doštičky.

Počítanie kolónií húb vo vzorke potravy. Agar zo zemiakovej dextrózy doplnený antibiotikami. Zdroj: Pxhere.com photo / 777267

Údržba kmeňov húb

Zemiakový dextrózový agar sa môže používať na udržanie životaschopných kmeňov húb počas niekoľkých rokov.

Na tento účel sa huba pestuje na klinoch zemiakového dextrózového agaru a po jej raste sa pokryje minerálnym olejom. Olej by mal byť sterilizovaný v autokláve počas 45 minút a mal by mať viskozitu približne 300 až 330 Sayboltov. Olej by mal byť 1 až 2 cm nad špičkou skosenia.

QA

Z každej pripravenej dávky odoberte 1 alebo 2 platne a inkubujte ich pri teplote 25 ° C počas 48 hodín alebo pri teplote 20 ° C počas 96 hodín. Dobrá kontrola sterility je taká, pri ktorej nie je pozorovaný vývoj kolónií.

Môžu sa použiť aj známe alebo certifikované kontrolné kmene, ako napríklad:

Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763, Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533. Vo všetkých prípadoch sa očakáva dobrý rast.

Referencie

1. Britannia Laboratories. Zemiaky na glukózovom agare. 2015.K dispozícii na: britanialab.com
2. Neogen Laboratories. Agar zemiakovej dextrózy. K dispozícii na adrese: foodsafety.neogen.com
3. Laboratórium insumolabu. Agar zo zemiakovej dextrózy. K dispozícii na adrese: insumolab.cl
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentína.
5. Casas-Rincón G. Všeobecná mykológia. 1994. 2. vydanie, Central University of Venezuela, Edícia knižníc. Venezuela Caracas.
6. Aceituno M. Hodnotenie mikrobiologickej kvality v očných tieňoch, kompaktný práškový typ národného výrobného laboratória, podľa referenčnej metódy Pharmacopea Usp 2005. Diplomová práca na získanie titulu farmaceutický chemik. Univerzita v San Carlos v Guatemale.
7. Cuétara M. Spracovanie povrchových vzoriek. Iberoamerican Journal of Mycology. 2007; pp. 1-12