Agar EMB je selektívna a diferenciálnej médium používané pre pevné izoláciu kultivačného Gram negatívnych baktérií, najmä Enterobacteriaceae a iných gramnegatívnych baktérií nenáročné. Je tiež známa skratkou EAM, ktorá predstavuje eozín-metylénovú modrú.
Toto médium vytvorili Holt-Harris a Teague v roku 1916. Obsahuje peptón, laktózu, sacharózu, fosforečnan draselný, agar, eozín, metylénovú modrú a vodu. Je veľmi podobný agaru MacConkey, najmä ak sa používa modifikovaný EMB agar Levine, ktorý neobsahuje sacharózu.
Kovový lesk Escherichia coli na agare EMB Zdroj: Carmen Moreno González, Wikimedia Commons
V skutočnosti sa každé laboratórium rozhodne, či bude pracovať s jedným alebo druhým, pretože plní rovnakú funkciu, hoci biochemicky sú odlišné.
Má dokonca rovnakú nevýhodu ako klasický agar MacConkey, pokiaľ ide o produkciu rojenia rodom Proteus. Preto, aby sa zabránilo tomuto javu, môže byť koncentrácia agaru zvýšená až o 5%.
základ
selektívne
EMB agar je jemne selektívny, pretože obsahuje anilínové farbivá (eozín a metylénová modrá), ktoré pôsobia ako inhibítory a bránia rastu väčšiny grampozitívnych baktérií a niektorých náročných gramnegatívnych tyčiniek.
Tento agar má však tú nevýhodu, že niektoré grampozitívne baktérie dokážu odolávať prítomnosti inhibičných látok a rastú ako malé bezfarebné bodkované kolónie, ako je Enterococcus faecalis a niektoré Staphylococcus.
Môžu tiež rásť určité kvasinky, napríklad komplex Candida albicans, ktorý poskytne veľmi malé ružové kolónie. Chlamydospory sa môžu vyvinúť z týchto kvasiniek, ak je vzorka hlboko naočkovaná.
diferenciál
Na druhej strane, EMB agar je tiež diferenčným médiom, pretože tieto farbivá spolu (eozín a metylénová modrá) majú tú vlastnosť, že pri kyslom pH vytvárajú zrazeninu, a preto slúžia ako ukazovatele jeho výroby.
Preto slabo baktérie fermentujúce laktózu alebo sacharózu vytvárajú fialové kolónie v priebehu 24 až 48 hodín. Napríklad rody Klebsiella, Enterobacter a Serratia.
Baktérie, ktoré silne fermentujú laktózu, ako je Escherichia coli alebo sacharóza, ako je Yersinia enterocolitica alebo Proteus penneri, tvoria zeleno-čiernu zrazeninu, ktorá u týchto druhov vykazuje charakteristický vzhľad kovového lesku.
Je potrebné poznamenať, že ak sa použije levinové médium EMB (bez sacharózy), Yersinia enterocolitica a Proteus penneri budú produkovať číre kolónie.
Baktérie, ktoré nefertujú laktózu ani sacharózu, sa živia prítomnosťou peptonov, ktoré poskytujú aminokyseliny a dusík potrebné pre bakteriálny rast, a vytvárajú číre kolónie. Napríklad rod Salmonella a Shigella.
Podobne je dôležité si uvedomiť, že rod Acinetobacter môže obsahovať kolónie levanduľovej modrej, hoci to nie je fermentor laktózy alebo sacharóza, ale má vlastnosť fixácie metylénovej modrej na svojej bunkovej stene. To sa môže stať aj pri iných oxidačných baktériách.
príprava
Pôvodné dehydrované médium je svetlo béžovej farby.
Na prípravu tohto kultivačného média sa musí odvážiť 36 gramov dehydratovaného média a suspendovať v banke obsahujúcej jeden liter destilovanej vody.
Potom, čo sa zmes nechá 5 minút v pokoji, vložte banku do zdroja tepla, dôkladne a neustále miešajte, až kým úplne nevarí a úplne sa nerozpustí.
Následne musí byť už rozpustené kultivačné médium sterilizované pomocou autoklávu pri 121 ° C počas 15 minút.
Na konci času sa vyberie z autoklávu a nechá sa krátko stáť. Potom, stále teplé (45 - 50 ° C), sa v každej sterilnej Petriho miske podáva 15 až 20 ml agaru. Médium by malo byť lakmusovo modré.
Po podaní sa misky nechajú nepatrne odkryté, až kým agar nepochladne. Potom sa zakryjú a nechajú sa úplne stuhnúť. Následne sú usporiadané v obrátených držiakoch platní a až do použitia sa uchovávajú v chladničke (8 ° C).
Tento postup sa výhodne uskutočňuje v laminárnom digestore alebo pred Bunsenovým horákom, aby sa zabránilo kontaminácii.
Je dôležité mať na pamäti, že v každom obchodnom dome sa uvedie množstvo, ktoré sa má odvážiť pri príprave kultivačného média.
Konečné pH média musí byť 7,2 ± 0,2
aplikácia
Toto médium sa používa na siatie moču a fekálií alebo akéhokoľvek typu klinickej vzorky, najmä ak existuje podozrenie na prítomnosť nestabilných gramnegatívnych bacíl, ako sú bacily patriace do čeľade Enterobacteriaceae, ktoré na tomto médiu veľmi dobre rastú.
Enteropatogénne baktérie rodov Shigella a Salmonella sa vyznačujú svojimi bezfarebnými alebo mierne jantárovými kolóniami.
Rastú aj ďalšie nemliečne fermentujúce bacily, ako sú Aeromonas, Pseudomonas, Acinetobacter.
Podobne je toto médium veľmi užitočné pri mikrobiologickej analýze potravy a vody, pretože je ideálne pre úplnú konfirmačnú fázu stanovenia koliformných baktérií, to znamená na potvrdenie prítomnosti E. coli z kalných EC bujónov, z najpravdepodobnejšej číselnej techniky (MPN).
QA
Aby sa overilo, že čerstvo pripravené kultivačné médium funguje dobre, je možné vysadiť kontrolné kmene, aby sa sledovali vlastnosti kolónií a overilo sa, či dávajú podľa očakávania.
Na tento účel sa môžu použiť kmene ATCC alebo dobre identifikované kmene E. coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella sp, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa a niektoré grampozitívne baktérie, ako napríklad S. aureus.
Očakáva sa, že E. coli vytvorí dobre vyvinuté modro-čierne kolónie so zeleným kovovým leskom. Keďže Enterobacter aerogenes a Klebsiella sp by mali dať dobre vyvinuté modro-čierne sliznice.
Na druhej strane, Salmonella typhimurium a Shigella flexneri, si musia vyvinúť veľké kolónie, bezfarebné alebo s jemnou jantárovou farbou.
Nakoniec rod Pseudomonas aeruginosa rastie ako bezfarebné kolónie nepravidelnej veľkosti, zatiaľ čo grampozitívne baktérie by sa mali úplne inhibovať alebo riedko rásť s veľmi malými kolóniami.
Záverečné myšlienky
Sterilizácia niekedy spôsobí, že sa metylénová modrá zníži a bude mať stredne oranžovú farbu. Aby mohla metylénová modrá oxidovať a získať fialovú farbu, musí sa jemne premiešať, až kým sa farba nezíska.
Po sterilizácii sa môže farbivo vyzrážať, preto by sa malo pred podávaním Petriho misiek dobre premiešať.
Referencie
- Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B a Velázquez O. 2009. Techniky pre mikrobiologickú analýzu potravín. 2. vydanie. Chemická fakulta, UNAM. Mexiko.
- Carranza C, León R, Falcón N, Neumann A, Kromm C. Charakterizácia a distribúcia potenciálne patogénnych kmeňov Escherichia coli izolovaných z brojlerových kurčiat z hydinových fariem v Peru. Rev. vet. Peru 2012 23 (2): 209-219. K dispozícii na: scielo.org.
- Laboratórium Conda SA, eozín a metylénový modrý agar. 2010. K dispozícii na adrese: condalab.com
- Britannia Laboratories. Levine EMB (s eozínovou a metylénovou modrou) 2011. Dostupné na: britanialab.com
- Laboratóriá BD. BD EMB agar (eozínový metylénový agar), modifikovaný. 2013. K dispozícii na: bd.com
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. (5. vydanie). Argentina, Editorial Panamericana SA
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Argentína. Editorial Panamericana SA