ŠTANDARDNÁ AGAROVÁ GUĽÔČKA: ZÁKLAD, PRÍPRAVA A POUŽITIE - BIOLÓGIE - 2026

Štandardné počet agar je pevný, neselektívny kultivačné médium, určené pre kvantifikáciu aeróbne mikrobiálne zaťaženie prítomné vo vzorkách pitnej vody, odpadové vody, mliečnych nápojov, medzi iné potraviny. Toto médium je tiež známe ako PCA agar, pre jeho skratku v anglickom platňovom agare. Bol vytvorený v roku 1953 Buchbinderom, Barisom a Goldsteinom.

Médium pre štandardný počet sa skladá z kvasnicového extraktu, tripteínu, glukózy, agaru a destilovanej vody. Táto formulácia obsahuje základné výživové prvky, ktoré umožňujú rozvoj súčasnej aeróbnej mikrobiálnej záťaže, ktorá nie je náročná.

Desatinné riedenia na počítanie CFU v štandardných počtoch agaru. Zdroj: Quentin Geissmann

Pretože médium neobsahuje inhibítory, baktérie môžu rásť bez akýchkoľvek obmedzení, čo z neho robí ideálny materiál na všeobecné počítanie kolónií. Technika kvantifikácie plakov však nedeteguje všetky prítomné baktérie, ale iba tie baktérie, ktoré sú schopné rásť v podmienkach prostredia, ktorým je naočkovaný agar so štandardným počtom.

V tomto zmysle sa technika kvantifikácie doštičiek vo všeobecnosti snaží určiť množstvo baktérií aeróbneho mezofilného typu, to znamená tých, ktoré rastú pri teplotách medzi 25 a 40 ° C, s optimálnou rastovou teplotou 37 ° C. ,

Táto bakteriálna skupina je veľmi dôležitá, pretože sa tu nachádza väčšina patogénnych baktérií pre človeka.

Je potrebné poznamenať, že niekedy môže byť zaujímavé kvantifikovať množstvo psychrofilných baktérií prítomných v potrave. Tieto baktérie sú tie, ktoré rastú pri nízkych teplotách (<20 ° C) a sú zodpovedné za rýchlejšie rozkladanie potravín, a to aj pri chladení.

Podobne aj termofilné baktérie, ktoré sa vyvíjajú v rozmedzí od 50 ° C do 80 ° C alebo viac, môžu byť dôležité pri určitých druhoch potravín, ako sú konzervované potraviny.

Mikrobiálna kvantifikácia sa vyjadruje v jednotkách tvoriacich kolónie (CFU) na gram alebo mililiter vzorky.

základ

Médium pre štandardné počítanie je navrhnuté tak, aby umožňovalo úspešný rast nestabilných aeróbnych baktérií, pretože kvasnicový extrakt, tripteín a glukóza poskytujú živiny potrebné pre dobrý mikrobiálny rast.

Na druhej strane má médium svetlú farbu a priehľadný vzhľad, a preto je ideálne na vizualizáciu kolónií vyvinutých metódou hlbokého očkovania (nalievanie doštičiek).

Je tiež možné počítať kolónie metódou očkovania povrchu špachtľou Drigalski.

Ak je mikrobiálna záťaž vysoká, musí sa urobiť desatinné riedenie vzorky štúdie, aby bolo možné spočítať CFU.

Je potrebné poznamenať, že toto médium odporúča Americká asociácia verejného zdravia (APHA) pre počet aeróbnych mezofilov.

príprava

Naváži sa 23,5 g dehydratovaného média a rozpustí sa v litri destilovanej vody. Aby sa zmes úplne rozpustila, zmes by sa mala zahrievať častým miešaním, až kým nezačne vrieť. Nasledujúce kroky závisia od použitej techniky očkovania.

Pre techniku ​​nalievania doštičiek

Rozdeľte rozptýlením 12 až 15 ml do skúmaviek. Následne sa sterilizuje v autokláve pri 121 ° C počas 15 minút. Nechajte zvislo tuhnúť v tvare bloku. Skladujte v chladničke až do použitia.

Keď ho budete používať, roztavte zástrčku. Po roztopení uchovajte vo vodnom kúpeli pri 44 - 47 ° C, kým sa vzorky pripravia.

Na sejbu povrchu

Médium sa sterilizuje v autokláve pri 121 ° C a potom sa rozdelí 20 ml do sterilných Petriho misiek. Nechajte stuhnúť, prevráťte ju a uložte do chladničky až do použitia.

Platne pred použitím temperujte. PH média by malo byť 7,0 ± 0,2.

použitie

Standard Count Agar sa používa v aeróbnej mezofilnej technike počítania počas mikrobiologickej analýzy vody a potravy. Počet aeróbnych mezofilov je nevyhnutný, pretože určuje hygienickú kvalitu skúmanej vzorky.

Aplikácia tejto techniky (s použitím tohto média) umožňuje makroskopickú vizualizáciu izolovaných kolónií na ich kvantifikáciu.

Technika nalievania doštičiek (hĺbkové očkovanie)

-Process

Táto technika pozostáva z:

1) Homogenizujte vzorku, aby sa prerozdelili prítomné baktérie.

2) Počiatočná suspenzia sa pripravuje v sterilnej fľaši alebo vrecku, pričom sa rešpektuje pomer 10 g alebo 10 ml vzorky v 90 ml riedidla (10 - ¹ ).

3) Z počiatočnej suspenzie sa vykonajú príslušné desatinné riedenia v závislosti od typu vzorky. Príklad: ( ^10-2 , ^10-3 , ^10-4 ). Riedenia sa uskutočňujú peptónovou vodou alebo fosfátovým pufrom.

Za týmto účelom odoberte 1 ml počiatočnej suspenzie a vložte ju do 9 ml riedidla, v prípade potreby pokračujte v riedení, teraz odoberte 1 ml roztoku s koncentráciou ^10-2 atď.

4) Zoberte 1 ml každého riedenia a vložte do prázdnych sterilných Petriho misiek.

5) Do každej platne sa pridá 12 až 15 ml štandardného počtu agaru, ktorý bol predtým roztavený a usadený pri 44 - 47 ° C.

6) Doštičky jemne otáčajte, aby sa vzorka rovnomerne rozdelila pozdĺž agaru a nechala sa stuhnúť.

7) Platne sa prevrátia a inkubujú sa pri aerobióze pri teplote 37 ° C počas 24 až 48 hodín.

8) Na konci času sa doštičky preskúmajú a kolónie sa spočítajú v riedení, ktoré to umožňuje. Doštičky, ktoré majú medzi 30 až 300 CFU, sa vyberú pre počet.

Počítanie sa môže vykonať ručne alebo môžete použiť zariadenie na počítanie kolónií.

Hodnoty povolené na 1 ml vzorky sa môžu v jednotlivých krajinách líšiť v závislosti od nariadení, ktorými sa riadia.

- Výpočet UFC

Všeobecný výpočet sa vykonáva pomocou tohto vzorca:

Vzorec pre všeobecný výpočet kvantifikácie CFU. Zdroj: Národná správa liekov, potravín a zdravotníckych technológií (ANMAT). Mikrobiologická analýza potravín, úradná analytická metodika, indikátorové mikroorganizmy. 2014, zväzok 3. K dispozícii na: anmat.gov.ar

Výsledky vyjadrte 1 alebo 2 číslicami vynásobením príslušnou základňou 10. Príklad: v prípade, že výsledok je 16,545, je zaoblený, vztiahnuté na tretie číslo do 17.000 a bude vyjadriť takto: 1,7 x 10 ⁴ . Teraz, ak je výsledok boli 16436, okolo toho 16,000 a vyjadriť 1,6 x 10 ⁴ .

Technika očkovania povrchov

-Process

- Inokulujte 0,1 ml priamej vzorky, ak je to kvapalina, počiatočná suspenzia ^10-1 alebo následné riedenia 10 ^-2 , 10 ^-3 atď., V strede doštičky so štandardným počtom agarov.

- Rozdeľte vzorku rovnomerne stierkou Drigalski alebo sklenenou tyčou tvaru L. Nechajte ju 10 minút odstáť.

- Platničky prevráťte a inkubujte aeróbne pri 37 ° C počas 24 až 48 hodín.

- Pokračujte v počítaní kolónií, vyberte platne, ktoré sú v rozsahu medzi 20 - 250 CFU.

- Výpočet UFC

Na výpočet sa použije zrieďovací faktor, ktorý je inverzný. Číslo sa zaokrúhli na 2 platné číslice (zaokrúhlenie podľa tretej číslice) a je vyjadrené v sile bázy 10. Napríklad, ak sa vo vzorke počíta 224 CFU bez riedenia (10 ^-1 ), vykazuje sa 22 x 10 ¹ CFU. , ale ak to bolo 225, uvádza sa 23 x 10 ¹ CFU.

Teraz, ak 199 CFU sa počítajú v 10 ^-3 riedenie , 20 x 10 ⁴ CFU budú uvedené, ale v prípade, 153 CFU sa počítajú v rovnakom riedení 15 x 10 ⁴ CFU budú uvedené.

QA

Kultivačné médium pre štandardný počet sa môže hodnotiť pomocou známych certifikovaných kmeňov, ako napríklad: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Ak je kultivačné médium v ​​optimálnych podmienkach, vo všetkých prípadoch sa očakáva uspokojivý rast, s výnimkou L. fermentum, ktorý môže mať pravidelný výnos.

Aby sa vyhodnotila sterilita kultivačného média, mala by sa jedna alebo dve misky každej pripravenej šarže (bez inokulácie) inkubovať pri 37 ° C v aerobióze počas 24 hodín. Po uplynutí tejto doby by sa v médiu nemal pozorovať rast ani zmena farby.

obmedzenia

- Neroztavujte agar viackrát.

- Pripravené médium môže trvať až 3 mesiace, pokiaľ je uchovávané v chladničke a chránené pred svetlom.

- Toto médium nie je vhodné pre náročné alebo anaeróbne mikroorganizmy.

Referencie

1. Národná správa liekov, potravín a zdravotníckych technológií (ANMAT). Mikrobiologická analýza potravín, úradná analytická metodika, indikátorové mikroorganizmy. 2014, zväzok 3. K dispozícii na: anmat.gov.ar
2. Laboratorios Difco Francisco Soria Melguizo, agar s počtom doštičiek. 2009. Dostupné na: http://f-soria.es
3. Conda Pronadisa Laboratories. Agar štandardnej metódy (PCA) podľa APHA a ISO 4833. Dostupné na: condalab.com
4. Britannia Laboratories. Počet agarových doštičiek. 2015.K dispozícii na: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B a Velázquez O. 2009. Techniky pre mikrobiologickú analýzu potravín. 2. vydanie. Chemická fakulta, UNAM. Mexiko. K dispozícii na adrese: depa.fquim.unam