PROTEINÁZA K: CHARAKTERISTIKA, ENZYMATICKÁ AKTIVITA, APLIKÁCIE - BIOLÓGIE - 2026

K proteináza je enzým, ktorý patrí do skupiny serínových proteáz, tj, že má vo svojej strednej katalyticky aktívny serínové aminokyselín a má funkciu lámanie peptidové väzby hydrolýzou. Tento enzým zasa patrí do rodiny subtilizínových proteínov (peptidáza S8).

Proteináza K má molekulovú hmotnosť (MW) 28 900 daltonov a bola prvýkrát izolovaná v roku 1974 v extraktoch z huby Engyodontium album, predtým známej ako Tritirachium album Limber.

Molekulárna štruktúra proteíninázy K. Zdroj: Lykchiniadis

Má vysokú proteolytickú kapacitu, čo dokazuje degradácia keratínu prítomného vo vlasoch. Slovo keratín v angličtine sa označuje ako „keratín“, preto sa nazýva „proteináza K“.

Vďaka svojej vysokej schopnosti štiepiť natívne proteíny je tento enzým užitočný v rôznych technikách molekulárnej biológie. Používa sa predovšetkým na izoláciu a prípravu nukleových kyselín s vysokou molekulovou hmotnosťou (MW).

Proteináza K účinkuje tak, že uvoľňuje jadrovú DNA, zatiaľ čo ničí proteíny a inaktivuje RNázy a DNázy, to znamená, že odstraňuje nukleázy v prípravkoch DNA a RNA.

Na druhej strane sa zistilo, že proteináza K môže hydrolyzovať niektoré denaturované natívne proteíny, čo vzbudilo záujem vedcov o jej použitie pri štúdiu priónových proteínov (PrPC).

Avšak napriek ich vysokej proteolytickej účinnosti existujú proteíny, ktoré sú rezistentné na pôsobenie proteinázy K. Medzi nimi sú niektoré abnormálne proteíny nazývané prióny (PrPSc), spojené s prenosnými spongiformnými encefalopatiami.

Charakteristiky proteázy K

Proteináza K má terciárnu štruktúru pozostávajúcu z troch vrstiev, so 7-reťazcovou P vrstvou umiestnenou medzi dvoma vrstvami helixov. Pretože patrí do rodiny S8 peptidáz, vyznačuje sa tým, že má na svojom aktívnom mieste katalytickú triádu, ktorej sekvenčné poradie je (Asp, His a Ser), ktoré ich odlišuje od ostatných rodín peptidáz.

Tento enzým zo skupiny serínových proteáz sa vyznačuje hydrolýzou peptidových väzieb v blízkosti karboxylovej skupiny alifatických a aromatických aminokyselín.

Na druhej strane je schopný pôsobiť v prítomnosti určitých žieravých látok, ako je dodecylsulfát sodný (SDS), Tris-HCL a EDTA, ktoré sa používajú na podporu denaturácie proteínov, čo spôsobuje, že strácajú svoju pôvodnú štruktúru.

Toto je predbežný krok pri príprave proteínov pre elektroforetickú techniku. Rozsah pH, ​​pri ktorom proteináza K pôsobí, je pomerne široký (2,0 až 12,0), s optimálnym pH medzi 7,5 až 12,0 a jeho izoelektrický bod je 8,9. Ako je zrejmé, je aktívny proti veľmi širokému rozsahu pH.

Ďalšou charakteristikou, ktorá vyniká v proteináze K, je jej stabilita v prítomnosti vysokých teplôt (50 - 60 ° C).

Enzymatická aktivita

Proteináza K vyžaduje prítomnosť vápnikového iónu, hoci to nemá vplyv na jeho aktivitu, ak je nevyhnutné zachovať jeho stabilitu.

Aby proteináza K úplne strávila substrát, je potrebná doba kontaktu približne 5 minút až 2 hodiny.

V tomto zmysle však Daza a kol., Porovnali čistotu DNA získanú v rôznych časoch expozície proteináze K a dospeli k záveru, že predĺžená inkubácia (až 24 hodín) významne zlepšuje kvalitu DNA.

Avšak vo vzťahu ku koncentrácii enzýmu proteinázy K použitého v rôznych protokoloch je možné povedať, že je veľmi rôznorodý.

Môže sa používať od veľmi nízkych koncentrácií (5 µg / ml) do koncentrácií 500 µg / ml. Najbežnejšie pracovné koncentrácie sa však pohybujú od 50 do 100 μg / ml, najmä pri štiepení proteínov a inaktivácii nukleáz. Aj keď sa na ošetrenie tkanív vyžaduje koncentrácia 2 mg / ml.

aplikácia

Jeho aplikácie sú veľmi široké a možno ich zhrnúť takto:

- Používa sa pri trávení proteínov a pri extrakcii DNA rôznymi metódami, ako sú: vysoľovanie, PK-SDS, cetyltrimetylamóniumbromid (CTAB), modifikovaný octan draselný a extrakcia jodidom sodným.

- Inaktivácia nukleáz (RNázy a DNázy).

-V in situ hybridizačnej technike (HIS) na podporu uvoľňovania nukleovej kyseliny, okrem eliminácie nežiaducich proteínov.

- Modifikácia proteínov.

- Na úrovni výskumu, v rôznych štúdiách.

Výhody proteinázy K

Uskutočnilo sa niekoľko porovnávacích štúdií medzi technikami extrakcie DNA, ktoré používajú proteín K, s inými, ktoré ju nepoužívajú, a všetky dospeli k záveru, že pri použití enzýmu sú väčšie výhody. Medzi výhody patrí:

- Získa sa DNA s vysokou molekulovou hmotnosťou, vysokou kvalitou a čistotou.

- Extrahovaná DNA je stabilná až 3 mesiace.

Extrahovaná DNA sa môže použiť v nasledujúcich technikách: Southern blot, polymerázová reťazová reakcia (PCR), elektroforéza.

Proteináza K rezistentné proteíny

Rôzne výskumy dospeli k záveru, že prióny (abnormálne toxické PrPSc proteíny) sa líšia od PrPC (natívnych) proteínov tým, že sú rezistentné voči pôsobeniu proteinázy K, zatiaľ čo PrPC sú citlivé na tento účinok.

Iní autori opísali, že v štruktúre PrPSc sú citlivé časti a iné rezistentné na proteinázu K. Avšak obe časti sú rovnako toxické a infekčné.

Na druhej strane Bastian a kol., V roku 1987, izolovali 4 proteíny 28, 30, 66 a 76 kda z druhu Spiroplasma mirum. Zistilo sa, že všetky sú rezistentné na pôsobenie proteinázy K a tiež mali krížovú reakciu s niektorými priónmi.

Je známe, že tento druh môže spôsobiť šedý zákal a významné neurologické poškodenie, a vďaka Bastianovým vedeckým zisteniam sa okrem iného uskutočnil pokus o spojenie tohto mikroorganizmu s prenosnými spongiformnými encefalopatiami.

Etiológia tejto degeneratívnej neurologickej patológie sa však dnes pripisuje priónom.

V tomto zmysle Butler a kol., V roku 1991 identifikovali a charakterizovali triedu proteínov rezistentných na proteinázu K 40 kda z dvoch kmeňov Mycoplasma hyorhinis. Tento patogén postihuje ošípané a infikuje ich tkanivá, ale v tomto prípade nedošlo k krížovej reakcii s testovanými priónmi.

Na vyriešenie mnohých neznámych v tomto ohľade je potrebný ďalší výskum.

Referencie

1. Bastian F, Jennings R a Gardner W. 1987. Antisérum na vláknitý proteín spojený so scrapie krížovo reaguje s vláknitými proteínmi Spiroplasma miru m. J. Clin. Microbiol. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, Rey J, Ruiz V. Hodnotenie metódy extrakcie a purifikácie DNA z formaldehydom fixovaného svalového tkaniva neidentifikovaných mŕtvol. Med Magazine, 2014; 22 (1): 42-49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M., Evancho S., Stanbridge E. a Mcgarrity G. Identifikácia a charakterizácia proteínov K-rezistentných na proteíny u členov triedy Mollicutes. Infection and Immunity, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L., a kol. Porovnanie dvoch extrakčných protokolov Trypanosoma cruzi DNA pestovaných v axenickom médiu. Peru. Med. Exp. Public Health 2014; 31 (2): 222 - 227. K dispozícii na: scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E a Palma W. Stanovenie účinnosti piatich protokolov extrakcie DNA z parafinizovaného materiálu pre molekulárne štúdie. Rev Méd Univ Kostarika. 2007; 1 (1): 10-19.