IMUNOFLUORESCENCIA: ZDÔVODNENIE, PROTOKOL A APLIKÁCIE - BIOLÓGIE - 2026

Imunofluorescencie je výkonná technika imunologické farbenie pomocou protilátok kovalentne viazané k fluorescenčnými molekulami pre identifikáciu konkrétnych cieľov v bunkových vzoriek pevných na pevnom nosiči.

Táto technika zahŕňa mikroskopické pozorovanie s imunologickou špecifickosťou, čo umožňuje pozorovať živé alebo odumreté bunky, ktoré môžu predstavovať malé množstvá antigénov. Široko sa používa v oblasti výskumu, ako aj pri klinickej diagnostike rôznych patologických stavov.

Imunooznačenie aktínových vlákien v kardiomyocytových bunkách (Zdroj: Ps1415 prostredníctvom Wikimedia Commons)

Táto technika, najmä kvalitatívna (s niektorými kvantitatívnymi variantmi), sa musí týkať konkrétne vizualizácie vzorky pomocou produktového signálu fluoroforu, čo je fluorescenčná molekula naviazaná na protilátku a ktorá sa dá excitovať pri určitej vlnovej dĺžke. ,

V bunkovom kontexte je veľmi užitočné študovať prítomnosť / neprítomnosť a subcelulárne umiestnenie proteínov. Táto technika sa pôvodne používala v klinickom prostredí na diagnostikovanie vírusov, ako je chrípka a následne na mnoho ďalších infekčných chorôb.

Je to veľmi citlivá technika as vhodným mikroskopickým zariadením môže mať veľmi dobré rozlíšenie. Na jeho pozorovanie sa vyžaduje použitie konfokálnych alebo epifluorescenčných mikroskopov.

Napriek tomu, že je veľmi populárny, môže predstavovať niektoré dôležité problémy týkajúce sa získania nešpecifickej fluorescencie, ktorá vytvára určitý „hluk“ v pozadí, čo často obmedzuje primerané čítanie výsledkov.

základ

Imunofluorescencia je založená na využití biologického fenoménu interakčnej reakcie medzi protilátkou a antigénom. Týka sa to konkrétne vizualizácie alebo detekcie tejto reakcie excitáciou fluorescenčných molekúl na špecifickú vlnovú dĺžku.

Protilátka je imunoglobulínový proteín vylučovaný z aktívnych B buniek, ktorý je špecificky generovaný proti antigénu, na ktorý sa môže viazať s vysokou afinitou a špecifickosťou. Imunofluorescencia využíva imunoglobulíny IgG, ktoré sa nachádzajú v krvnom sére.

Protilátky sú molekuly do 950 kDa vyrobené z dvoch krátkych (ľahkých) a dvoch dlhých (ťažkých) peptidových reťazcov tvaru Y. Ľahký aj ťažký reťazec sú rozdelené do dvoch domén: jedna variabilná, schopná rozpoznávať antigén a druhá konštantná alebo konzervovaná, charakteristika každého druhu.

Antigény sú funkčne definované ako molekuly, ktoré sú rozpoznateľné protilátkou a sú to zväčša proteíny. Ak je zviera vystavené antigénu, aktivujú sa lymfocyty imunitného systému, pričom proti nemu vznikajú špecifické protilátky, ktoré fungujú ako obranný systém.

Antigén, ako napríklad proteín, môže mať viac ako jeden epitop alebo miesto rozpoznania protilátkou, takže sérum zvieraťa vystaveného antigénu môže mať polyklonálne protilátky proti rôznym oblastiam toho istého proteínu.

Imunofluorescencia potom využíva schopnosť zvieraťa produkovať polyklonálne protilátky proti špecifickému antigénu, aby ho vyčistila a následne ho použila na detekciu toho istého antigénu v iných kontextoch.

Medzi fluorescenčné farbivá alebo molekuly, ktoré sa najčastejšie používajú pri niektorých imunofluorescenčných technikách, sú fluoresceín izotiokyanát (FITC), tetrametylrhodamín izotiokyanát-5 a 6 (TRITC), veľa kyanínov ako Cy2, Cy3, Cy5 a Cy7 a farbivá s názvom Alexa Fluor®. , ako napríklad Alexa Fluor®448.

Protokol

Imunofluorescenčný protokol sa líši v závislosti od mnohých faktorov, všeobecne však zahŕňa lineárnu sekvenciu krokov pozostávajúcich z:

• Príprava platní a buniek
• Fixácia vzoriek
• permeabilizaci
• blokovanie
• Imunofarbenie alebo imunofarbenie
• Montáž a pozorovanie

-Preparation

Zo vzoriek

Príprava vzoriek bude závisieť od ich povahy a typu skúseností, ktoré sa majú vykonať. Najjednoduchší prípad, ktorý zahŕňa použitie buniek v suspenzii, bude vysvetlený nižšie.

Bunky v suspenzii, to znamená v tekutom kultivačnom médiu, sa musia najskôr z nej oddeliť odstredením a potom sa musia premyť tlmivým roztokom alebo izosmotickým „tlmivým roztokom“, ktorý zachováva ich integritu.

Normálne sa používa fosfátový soľný pufor známy ako PBS, v ktorom sú bunky resuspendované a táto zmes sa znovu odstredí, aby sa získali bunky bez kultivačného média, ktoré môže obsahovať interferujúce látky.

Z čepelí

Sklíčka použité na mikroskopické pozorovanie, kde budú bunky neskôr fixované pre zodpovedajúce následné ošetrenie, sa musia tiež starostlivo pripraviť.

Tieto sú pokryté alebo "senzibilizované" roztokom poly-lyzínu, syntetického polyméru, ktorý bude pôsobiť ako "molekulárne lepidlo" medzi bunkami a tuhým nosičom, vďaka elektrostatickej interakcii medzi kladnými nábojmi ich aminoskupín a negatívne náboje na proteínoch, ktoré obalujú bunky.

Fixácia vzoriek

Tento proces spočíva v imobilizácii proteínov nachádzajúcich sa vo vnútri bunky, aby sa zachovala ich priestorová poloha neporušená. Použité molekuly musia byť schopné prechádzať cez všetky typy bunkových membrán a tvoriť mriežky s kovalentnými proteínmi.

Široko sa používajú formaldehyd a paraformaldehyd, glutaraldehyd a dokonca metanol, s ktorým sa bunkové vzorky inkubujú určitý čas a potom sa premyjú izosmotickým tlmivým roztokom.

Po fixácii buniek sa bunky naďalej pripájajú k listom, ktoré boli predtým senzibilizované poly-lyzínom.

permeabilizaci

V závislosti od typu testu, ktorý sa vykonáva, bude potrebné permeabilizovať študované bunky alebo nie. Ak sa požaduje poznať umiestnenie, prítomnosť alebo neprítomnosť určitého proteínu na bunkovom povrchu, permeabilizácia nebude potrebná.

Na druhej strane, ak chcete poznať umiestnenie proteínu vo vnútri bunky, permeabilizácia je nevyhnutná a bude pozostávať z inkubácie vzoriek s Tritonom X-100, detergentom schopným permeabilizovať bunkové membrány.

blokovanie

Zásadným krokom vo všetkých imunologických technikách je blokovanie. V tomto štádiu postupu blokovanie spočíva v pokrytí všetkých miest poly-lyzínovými molekulami, na ktorých bunky nepriľnuli, na senzibilizovaných listoch. To znamená, že bráni nešpecifickému zjednoteniu.

Normálne sa na blokovanie používajú roztoky s hovädzím sérovým albumínom (BSA) v PBS tlmivom roztoku a najlepšie výsledky sa získajú, čím dlhšia je doba inkubácie s týmto roztokom. Po každom kroku vrátane blokovania je potrebné zvyšný roztok umyť.

Imunofarbenie alebo imunofarbenie

Postup imunofarbenia alebo imunofarbenia bude závisieť hlavne od toho, či ide o priamu alebo nepriamu imunofluorescenciu (pozri nižšie).

Pokiaľ ide o primárnu alebo priamu imunofluorescenciu, vzorky sa inkubujú s požadovanými protilátkami, ktoré sa musia spojiť s fluorescenčnými farbivami. Inkubačný postup spočíva v príprave riedenia protilátky v roztoku, ktorý bude tiež obsahovať BSA, ale v menšom pomere.

Ak ide o sekundárnu alebo nepriamu imunofluorescenciu, mali by sa vykonať dve po sebe idúce inkubácie. Najskôr s požadovanými protilátkami a potom s protilátkami, ktoré sú schopné detegovať konštantné oblasti primárnych imunoglobulínov. Sú to tieto sekundárne protilátky, ktoré sú kovalentne viazané na fluorofory.

Táto technika je veľmi univerzálna a umožňuje súčasné značenie viac ako jedného antigénu na vzorku, pokiaľ existujú primárne protilátky spojené s rôznymi fluoroformi, v prípade priamej imunofluorescencie.

Na súčasné označenie nepriamej imunofluorescencie je potrebné zabezpečiť, aby sa každá primárna protilátka produkovala u iného zvieraťa, a aby sa každá sekundárna protilátka naviazala na iný fluorofor.

Rovnako ako blokovanie, inkubácia s protilátkami dáva lepšie výsledky, čím dlhšia je táto doba. Po každom kroku je potrebné vyčistiť prebytočné protilátky, ktoré sa neviazali na vzorky, a pri sekundárnej imunofluorescencii je potrebné blokovať pred pridaním sekundárnej protilátky.

Niektoré techniky používajú iné škvrny, ktoré nesúvisia s imunofarbením, napríklad farbenie jadrovej DNA fluoroforom DAPI.

Montáž a pozorovanie

Počas poslednej inkubačnej doby s fluoroformi je potrebné, aby vzorky zostali v tme. Na pozorovanie pod mikroskopom je bežné používať niektoré látky na zachovanie fluorescencie fluoroforov spojených s protilátkami.

druhy

Grafické zhrnutie priamej a nepriamej imunofluorescencie (Zdroj: Westhayl618 prostredníctvom Wikimedia Commons)

Priama alebo primárna imunofluorescencia

Súvisí to s detekciou antigénov pomocou fluorescenčných protilátok. Hlavnou výhodou použitia tejto techniky je jej rýchlosť, v procese sa však môže vyskytnúť veľa prípadov nešpecifických väzieb, najmä pri štúdiu ľudských sér, pretože sú bohaté na vysoko heterogénne protilátky.

Nepriama alebo sekundárna imunofluorescencia

Je tiež známa ako „sendvičová“ technika a vyžaduje si to v dvoch krokoch. Prvá sa týka použitia nefluorescenčnej protilátky a jej väzby na požadovaný antigén.

Proti konštantnej oblasti tejto prvej protilátky (ktorá bude teraz slúžiť ako antigén) sa používa druhá protilátka, ktorá ju dokáže rozoznať a ktorá je spojená s fluorescenčnou molekulou.

Vzhľad fluorescenčného signálu bude výsledkom špecifického rozpoznania medzi prvou nefluorescenčnou protilátkou a záujmovým antigénom; prítomnosť tejto prvej protilátky je podmienkou prítomnosti druhej protilátky, ktorá je označená a vďaka ktorej je možné určiť prítomnosť alebo neprítomnosť antigénu.

Napriek tomu, že ide o oveľa časovo náročnejšiu techniku ​​ako priama imunofluorescencia (pretože zahŕňa jeden ďalší inkubačný krok), táto technika nezahŕňa navrhnutie fluorescenčnej protilátky pre každý študovaný antigén, čo vedie z ekonomického hľadiska k životaschopnejšie.

Ďalej je to citlivejšia technika z hľadiska amplifikácie signálu, pretože viac ako jedna sekundárna protilátka sa môže viazať na konštantnú oblasť primárnej protilátky, čím sa zosilňuje intenzita fluorescenčného signálu.

aplikácia

Ako už bolo uvedené, imunofluorescencia je mimoriadne všestranná technika, ktorá sa vo vedeckých a klinických odboroch používa mnohými spôsobmi. Môže sa použiť na zodpovedanie ekologických, genetických a fyziologických otázok týkajúcich sa mnohých organizmov.

Z klinických aplikácií sa používa na priamu diagnózu niektorých dermatologických ochorení, a to buď pomocou priamej alebo nepriamej imunofluorescencie na epitelovom tkanive študovaných pacientov.

Imunofluorescenčné techniky sú dostupné v jednobunkových organizmoch, ako sú napríklad kvasinky, na vizualizáciu intranukleárnych a cytoplazmatických mikrotubúl, aktínu a pridružených proteínov, 10nm vlákien a ďalších zložiek cytoplazmy, membrány a bunkových stien.

Referencie

1. Protokol Abcam, imunocytochémia a imunofluorescencia. Zdroj: abcam.com
2. Greph, C. (2012). Fluorescenčné farbivá. Zdroj: leica-microsystems.com
3. Miller, DM, a Shakest, DC (1995). Imunofluorescenčná mikroskopia. V Methods in Cell Biology (Zv. 48, str. 365 až 394). Academic Press, Inc.
4. Odell, ID a Cook, D. (2013). Imunofluorescenčné techniky. Journal of Investigative Dermatology, 133, 1-4.
5. Princle, BJR, Adams, AEM, Druain, DG, & Brian, K. (1991). Imunofluorescenčné metódy pre kvasinky. V Methods of Enzymology (Vol. 194, str. 565 - 602). Academic Press, Inc.
6. Schaeffer, M., Orsi, E. V. & Widelock, D. (1964). Aplikácia imunofluorescencie vo virológii verejného zdravia. Bacteriological Reviews, 28 (4), 402 - 408.
7. Vrieling, EG, and Anderson, DM (1996). Imunofluorescencia vo výskume fytoplanktónu: aplikácie a potenciál. J: Phycol. , 32, 1-16.