KULTIVAČNÉ MÉDIÁ: HISTÓRIA, FUNKCIA, TYPY, PRÍPRAVA - BIOLÓGIE - 2026

Tieto kultivačné médiá sú špeciálne výživové prípravky pre obnovu, izolácie a udržiavanie bakteriálnych a hubových mikroorganizmov. Tieto médiá môžu byť pevné, kvapalné alebo polotuhé.

Louis Pasteur bol prvý, kto ukázal, že v vývare vyrobenom z uvarených kúskov mäsa sa baktérie používali na rozmnožovanie vo veľkom počte až do zákalu vývaru. V tomto zmysle sa mäsový vývar z Pasteura považuje za prvé použité kvapalné kultivačné médium.

Surové a pripravené kultivačné médiá (tuhé a kvapalné). Zdroj: Flickr

Potom Robert Koch s pomocou svojich spolupracovníkov Julius Richard Petri a Walter Hesse urobili veľké pokroky. Prvý dizajn Petriho misky, ktorá sa dodnes používa; a druhý ho napadol nahradiť agar-agar želatinou za prípravu tuhých kultivačných médií, čo bolo veľmi dôležité, pretože želatína bola degradovaná niektorými mikroorganizmami.

V súčasnosti existuje veľa tried kultivačných médií s rôznymi účelmi, preto sú klasifikované podľa ich funkcie: medzi najdôležitejšie môžeme uviesť nutričné, selektívne, diferenciálne, transportné, obohacovacie a počítacie kultivačné médiá. kolónie, údržba a testovanie citlivosti.

Niektoré kultivačné médiá sú špeciálne na pozorovanie chemických reakcií a sú veľmi užitočné pri identifikácii príslušného mikroorganizmu. Medzi nimi možno spomenúť: Kliglerovo médium, MIO, LIA, citrát a iné.

histórie

Prvé kultivačné médium pripravil Louis Pasteur, keď sa pokúsil preukázať, že mikrobiálny život nie je produktom spontánnej generácie, ale že mikroorganizmy sa môžu množiť a tiež že pochádzajú zo vzduchu.

Pripravil vývar s kúskami mäsa a pozoroval, že po niekoľkých dňoch po vystavení vzduchu sa zakalil a v vývare bolo značné množstvo mikroorganizmov. Súčasne ďalší vývar s predtým uvarenými a hermeticky uzavretými kúskami mäsa zostal priesvitný, ako dni plynuli.

To upútalo pozornosť mnohých vedcov a uvedomili si, že tieto mikroorganizmy sú zodpovedné za rozklad mäsa a za spôsobenie niektorých chorôb.

Z tohto dôvodu bolo nevyhnutné vytvoriť spôsob, ako reprodukovať tieto mikroorganizmy v laboratóriu, aby sa mohli ďalej študovať.

V tomto zmysle Robert Koch neoceniteľným spôsobom prispel k zlepšeniu určitých laboratórnych techník, najmä techník týkajúcich sa izolácie baktérií, keď predstavil koncept pevného kultivačného média.

Najskôr používal plátky zemiaka ako pevné médium, ale neskôr pridal do masových vývarov želatínu s lepšími výsledkami. Avšak boli chvíle, keď sa želé roztavilo a zmenilo sa na tekutú kultúru. Dnes je známe, že k tomu dochádza, pretože niektoré baktérie sú schopné hydrolyzovať želatínu.

To bolo vtedy, keď jeden z jeho spolupracovníkov prišiel s myšlienkou používať agar-agar, zmes, ktorú jeho žena používala na zahusťovanie jej sladkostí.

Toto základné kultivačné médium sa postupne stávala sofistikovanejším, až kým nedosiahlo kultivačné médiá, ktoré sú dnes známe.

zloženie

Každé médium má odlišné zloženie, ale je nevyhnutné, aby obsahovalo špecifické živiny pre dobrý vývoj typu požadovaného mikroorganizmu.

Môže tiež obsahovať špecifické chemické látky, ktoré pomáhajú odhaliť metabolickú dráhu, ktorú má určitý kmeň alebo ktorá vykazuje prítomnosť určitých enzýmov.

Ďalším dôležitým prvkom je použitie tlmivých látok. Pomáhajú udržiavať osmotickú rovnováhu média, ako aj pH.

Môžu tiež obsahovať uhľohydráty a indikátor pH, ktorý ukazuje fermentáciu pridaného cukru. Ak dôjde k okysleniu vyvolanému fermentáciou, bude pozorovaná zmena farby média.

Niektoré kultivačné médiá obsahujú inhibičné látky. V závislosti od použitej látky bude rast niektorých mikroorganizmov obmedzený a u iných sa bude uprednostňovať.

Druhy kultivačných médií

Kultivačné médiá sú klasifikované podľa rôznych kritérií. Sú to: podľa konzistencie, zloženia a funkcie.

- Podľa jeho konzistentnosti

kvapaliny

Neobsahujú agar-agar. Bakteriálny alebo hubový rast sa prejavuje zákalom vývaru, ktorý je pôvodne priesvitný.

tuhý

Obsahujú 1,5 až 2% agarového agaru. Stuhnutá zmes má povrch, ktorý odoláva jemnému pohybu platinovej rukoväte bez toho, aby ju rozbila.

polotuhý

Obsahujú približne 0,5% agar-agar, preto je medziproduktom medzi kvapalinou a pevnou látkou. Ideálne pre médiá, ktoré slúžia na zobrazenie motility. Odporúčajú sa tiež na ochranu kmeňov, pretože udržujú vlhkosť omnoho dlhšie.

dvojfázová

Sú to médiá, ktoré sa pripravujú takým spôsobom, že existuje tuhá fáza a na nej kvapalné médium. Široko používaný pre krvné kultúry.

- Podľa zloženia

Prírodné pestovateľské médiá

Sú to látky získavané priamo z prírody na kultiváciu baktérií, ktoré im poskytujú prostredie čo najbližšie k tomu, ako sa bežne vyvíjajú v ekosystéme. Príklad: mlieko, džúsy, zriedená krv, sérum atď.

Syntetické kultivačné médiá

Dnes sa najčastejšie používajú, sú to dehydratované médiá, ktoré získavame v komerčných domoch a ktoré sú známe svojím chemickým zložením, pretože boli strategicky navrhnuté podľa typu izolovaného mikroorganizmu.

Polosyntetické kultivačné médiá

Je to kombinácia syntetického média, do ktorého je pridaný prírodný prvok na obohatenie média.

Médium pre bunkové kultúry

Sú špeciálnymi médiami na pestovanie vírusov, pretože tieto mikroorganizmy nie sú schopné prežiť mimo buniek, musia preto obsahovať tkanivo alebo živé bunky zo zvierat alebo rastlín.

Príklad: kultúry obličkových opíc opíc alebo embryonované vajíčka.

- Podľa jeho užitočnosti

Výživné, selektívne, diferenciálne, transportné, obohacovacie, identifikačné, kvantifikačné kolónie, udržiavacie a testovacie médiá. Budú opísané ďalej.

funkcie

Bez ohľadu na typ kultivačného média majú všetci niečo spoločné, to znamená, že uľahčujú alebo podporujú reprodukciu určitých mikroorganizmov. Rozdiel spočíva v zložení každej z nich, čo je určujúcim faktorom pre konečnú užitočnosť, ktorú budú mať.

Každé z existujúcich kultúrnych médií je strategicky navrhnuté pre špecifickú funkciu, pre ktorú bolo vytvorené, to znamená, že všetky majú základ, ktorý riadi usmernenia ich špecifickej funkcie.

Malo by sa poznamenať, že kultivačné médium po vysiatí musí byť vystavené teplotným a kyslíkovým podmienkam zodpovedajúcim typu baktérií alebo húb, ktoré sa majú izolovať.

Napríklad, ak chcete izolovať mezofilné anaeróbne baktérie, môžete použiť krvný agar a inkubovať pri anaeróbnych podmienkach (bez kyslíka) pri 37 ° C počas 48 hodín.

Ak je potrebné huba izolovať, používa sa agar Sabouraud s antibiotikami. Inkubuje sa v aerobióze pri izbovej teplote niekoľko dní, pretože tieto pomaly rastú.

Výživné jednoduché kultivačné médiá

Ako už názov napovedá, tieto kultivačné médiá obsahujú výživné látky, ako sú zdroje vitamínov, aminokyselín, dusík a uhlík, medzi ktoré môžeme spomenúť: mäsový extrakt alebo kvasnicový extrakt, kukuričný škrob, pankreatický trávnik, peptony, glukóza, okrem iného.

Obsahujú tiež ďalšie zložky, ktoré zabezpečujú osmotickú rovnováhu pre životné prostredie, pretože väčšina plodín vyžaduje pH blízko 7,0. Týmito prvkami môžu byť okrem iného chlorid sodný, fosforečnan sodný.

Riedidlo je destilovaná voda a pevné médium má agar-agar.

Účelom týchto kultivačných médií je získať bakteriálnu alebo hubovú mikrobiotu, ktorá existuje v danej vzorke. Nerozlišuje medzi mikroorganizmami, pretože je schopná pestovať veľké množstvo baktérií, grampozitívnych aj gramnegatívnych, ako aj kvasinkové a myceliálne huby.

Odporúčajú sa na očkovanie vzoriek z bežne sterilných miest. Nie sú však vhodné pre náročné mikroorganizmy.

Sú tiež užitočné na udržiavanie kmeňov, pokiaľ neobsahujú glukózu.

Obohatené kultúrne médiá

Ak sa do jednoduchého výživného média pridá krv alebo zahrievaná krv, stávajú sa obohatenými médiami (krvný agar a čokoládový agar).

Tieto médiá sú veľmi užitočné na očkovanie normálnych sterilných vzoriek, na záchranu slabých kmeňov a na izoláciu výživovo náročných mikroorganizmov.

Selektívne kultivačné médiá

Selektívne kultivačné médiá okrem toho, že obsahujú esenciálne živiny pre rast určitých požadovaných mikroorganizmov, sa tiež pridávajú inhibičné látky, ako sú okrem iného antibiotiká, antimykotiká, farbivá, žlčové soli.

Inhibičné látky sú určené na zníženie množstva kmeňov, ktoré môžu rásť, a podporujú rast zvlášť špeciálnej skupiny, ktorá sa má zachrániť.

Príklad: vývar ES (špeciálne pre koliformné baktérie celkom a fekálne kolónie) alebo agar Sabouraud s antibiotikami (špecifické pre huby).

Diferenčné kultivačné médiá

Diferenčné médiá obsahujú výživové prvky potrebné pre rast špecifickej skupiny mikroorganizmov a tiež obsahujú látky, ktoré budú v prítomnosti určitých mikroorganizmov metabolizované alebo degradované.

To znamená, že budú vyvolávať chemické reakcie, ktoré sa tak či onak prejavia v kultivačnom médiu.

Niektoré reakcie alkalizujú alebo okysľujú médium a vďaka prítomnosti indikátora pH sa tieto zmeny môžu prejaviť farebným posunom v médiu a v kolónii.

Preto sa medzi veľkou skupinou baktérií, ktoré budú schopné rásť v tomto médiu, budú rozlišovať tie, ktoré látku metabolizujú alebo degradujú, a tie, ktoré sa jednoducho nerozpoznajú iba pozorovaním farby kolónie a média.

Napríklad krvný agar rozlišuje baktérie, ktoré spôsobujú beta hemolýzu (jasný halo), od baktérií, ktoré spôsobujú alfa hemolýzu (nazelenalý halo), a tie, ktoré neprodukujú hemolýzu.

Selektívne a diferenciálne médiá

Príkladom toho je to, čo sa deje na agare MacConkey. Je selektívny, pretože umožňuje iba rast gramnegatívnych bacilov; a je odlišná, pretože baktérie fermentujúce laktózu (kolónie fuchsie) je možné odlíšiť od nekvasiacich baktérií (svetloružová alebo bezfarebná).

Transportné kultivačné médiá

Ako už názov napovedá, jedná sa o prostriedky používané na prepravu vzoriek odobratých na viac či menej vzdialenom mieste do laboratória, ktoré spracuje vzorku. Transportné médium udržuje vzorku v najlepších podmienkach, aby sa získali spoľahlivé výsledky.

Tieto kultivačné médiá majú veľmi zvláštne vlastnosti, pretože nemôžu byť prekročené v živinách, pretože bakteriálna populácia, ktorá je prítomná, musí zostať životaschopná, ale bez zvyšovania ich počtu.

Spravidla ide o polotuhé médium, ktoré umožňuje, aby vzorka zostala hydratovaná. Pri získavaní vzorky do laboratória by sa však nemal robiť nijaký kompromis. Príklady dopravných prostriedkov: Stuart medium, Cary Blair a Amies.

Obohatenie kultivačných médií

Tieto kultivačné médiá sú kvapalné. Používajú sa na záchranu konkrétnych patogénov, ktoré sa môžu v danom čase nachádzať vo vzorke v minimálnom množstve.

Je tiež užitočné zachrániť patogénny kmeň, ktorý môže byť slabý z akejkoľvek predchádzajúcej liečby. Napríklad: peptónová voda, tioglykolátový vývar a selenitový vývar.

Tieto médiá obsahujú inhibičné látky, ktoré bránia rastu sprievodnej mikrobioty, a špecifické živiny, ktoré podporujú vývoj požadovaných mikroorganizmov.

Kultivačné médiá na účely identifikácie

Tieto médiá obsahujú látky, ktoré môžu byť chemicky metabolizované určitými baktériami a vyvolávajú chemické reakcie, ktoré preukazujú prítomnosť špecifických enzýmov alebo metabolických ciest.

Preto sa používajú ako biochemické testy, ktoré pomáhajú pri rozpoznávaní rodu a druhu konkrétnej skupiny kmeňov. Príklad: Kliglerovo médium ukazuje, či je mikroorganizmus schopný fermentovať glukózu a laktózu, ak vytvára sírovodík a plyn.

Toto médium obsahuje odhaľujúce látky, ktoré umožňujú pozorovanie reakcie, ako je indikátor pH, a ióny železa.

Tento jednoduchý test môže rozlíšiť dve veľké skupiny bakteriálnych mikroorganizmov, ako napríklad baktérie patriace do čeľade Enterobacteriaceae, od takzvaných nekvasiacich baktérií.

Médiá na počítanie kolónií

Jedná sa o jednoduché neselektívne médiá, ktoré slúžia na kvantifikáciu mikrobiálnej populácie, ako je napríklad štandardné médium na počítanie. Typ mikroorganizmu, ktorý bude rásť v tomto médiu, bude závisieť od teploty a podmienok kyslíka, ktoré sú stanovené.

Kultivačné médiá na testovanie citlivosti

Štandardizovaným médiom na tento účel je Müeller Hintonov agar, toto médium je ideálne na vyhodnotenie správania rôznych antibiotík proti izolovanému patogénnemu mikroorganizmu.

Je zvlášť užitočný pri nenáročných baktériách, zatiaľ čo v náročných baktériách sa môže použiť iba vtedy, ak je doplnený krvou.

Kultivačné médiá na údržbu

Účelom týchto prostriedkov je reprodukovať mikroorganizmus a tiež udržiavať životaschopnosť baktérií alebo húb tak dlho, ako je to možné, a tiež zachovať jeho fyziologické funkcie.

Dôležitou charakteristikou je, že tento typ média by nemal obsahovať glukózu, pretože hoci je to prvok, ktorý poskytuje rýchly rast, jeho fermentáciou sa tiež produkujú kyseliny, ktoré znižujú životnosť mikroorganizmu.

Niektoré laboratóriá musia zachovať životaschopnosť určitých mikroorganizmov pre neskoršie použitie vo výskumných štúdiách, vnútorných kontrolách alebo na vzdelávacie účely.

príprava

V súčasnosti existuje mnoho komerčných značiek, ktoré distribuujú rôzne kultivačné médiá. Médiá sa dodávajú v lyofilizovanej alebo dehydratovanej forme, sú obsiahnuté vo vzduchotesných nádobách a sú chránené pred svetlom.

Každé médium sa dodáva so štítkom s uvedením názvu média, jeho zložiek, čísla šarže a hmotnosti, ktorá sa má pripraviť, aby sa pripravil liter kultivačného média.

Ako riedidlo sa používa destilovaná voda. Navážené množstvo sa rozpustí v jednom litri destilovanej vody, až kým sa zmes homogenizuje. Väčšina médií sa autoklávuje pri tlaku 15 libier pri teplote 121 ° C počas 15 minút.

Kvapalné médiá sa autoklávujú už distribuované v príslušných pracovných skúmavkách, zatiaľ čo pevné médiá sa autoklávujú v Erlenmeyerových bankách.

Tieto sa nechajú stáť, až kým nedosiahnu teplotu 55 ° C a sú podávané v Petriho miskách vo vnútri laminárneho prúdiaceho krytu alebo blízko horáka Bunsen. Nechajú sa stuhnúť a uložia sa v chladničke hore nohami.

Existujú tiež tuhé kultivačné médiá, ktoré sú distribuované v skúmavkách, čo im umožňuje stuhnúť buď v kolíkoch (rovné) alebo v zobáku s drážkou (naklonené).

Pred použitím akéhokoľvek pripraveného kultivačného média, či už pevného alebo tekutého, musí byť pred vysiatím vzorky temperované.

dôležitosť

Kultivačné médiá sú nepochybne veľmi cenným pracovným nástrojom pre mikrobiológov, pretože umožňujú regeneráciu infekčného agens, ktorý v určitom okamihu môže ovplyvniť jednotlivca alebo kontaminovať potravu, životné prostredie alebo povrch.

V tomto zmysle možno povedať, že mikrobiológia má rôzne oblasti, medzi inými klinickú, priemyselnú, environmentálnu, mikrobiológiu potravín a vo všetkých sa používajú kultivačné médiá.

Typ použitého média sa samozrejme môže líšiť v závislosti od potrieb a typu spracovávanej vzorky. Vplyv hľadala aj skupina mikroorganizmov.

Izolácia patogénneho mikroorganizmu alebo príčina akejkoľvek kontaminácie je nevyhnutná na to, aby bolo možné uskutočniť účinnú liečbu alebo prijať postupy, ktoré pomôžu vylúčiť príslušnú kontaminujúcu látku.

V prípade klinickej mikrobiológie je dôležité nielen izolovať mikroorganizmus a identifikovať ho (poznať rod a druh), ale musí sa vykonať aj antibiogram.

Táto štúdia, ktorá používa aj kultivačné médium, nám umožní povedať, ktoré antimikrobiálne látky sú citlivé a ktoré sú rezistentné alebo skrátka použiteľné ako liečba a ktoré nie.

V mikrobiologickom laboratóriu teda nemôžu v žiadnom prípade chýbať kultivačné médiá.

Nakoniec je možné povedať, že kultivačné médiá umožnili skúmať rôzne aspekty baktérií a húb.

Kontrola kvality kultivačných médií

Príprava a použitie kultivačných médií by sa nemalo robiť ľahšie. V každom laboratóriu musí byť oddelenie, ktoré aplikuje protokoly kontroly kvality na médium vždy, keď sa pripravia nové šarže, a tak sa zabezpečí, že sú správne pripravené, sterilné a funkčné.

Na posúdenie ich sterility sa z každej šarže náhodne vyberie jedno alebo dve médiá a inkubujú sa pri teplote 37 ° C počas niekoľkých dní (nemalo by dôjsť k rastu). Na overenie ich funkcie sa používajú náležite kultivované a životaschopné referenčné kmene ATCC (American Type Culture Collection).

Likvidácia kultivačných médií

Po použití kultivačného média sa musí médium zlikvidovať tak, aby neznečistilo životné prostredie.

Z tohto dôvodu sa materiál pred likvidáciou sterilizuje v autokláve. Následne sa materiál odstráni zo skla. Ten sa potom premyje, vysuší, sterilizuje a uloží na ďalšie použitie. V prípade použitia jednorazových platní sa tieto sterilizujú a neskôr zlikvidujú v špeciálnych vreckách.

Referencie

1. Mikrobiológia Borrego v známkach VIII. Robert Koch: Triumf vytrvalosti (I). SEM 2018, 117 (1): 1-18 Univerzita v Malage. K dispozícii na: jornades.uab.cat/
2. Volcy C. Genéza a vývoj Kochových postulátov a ich vzťah k fytopatológii. Recenzia v Kolumbii. 2008; 26 (1): 107-115. K dispozícii na: scielo.org.co/
3. Hrad Burguet Nancy, hrad Abraham Lourdes. Kontrola kvality kultivačných médií používaných pri environmentálnom monitorovaní klasifikovaných produkčných oblastí. Rev Cubana Hig Epidemiol 2013; 51 (2): 155 - 160. K dispozícii v: scielo.
4. Bonilla M, Pajares S, Vigueras J, Sigala J, Le Borgne S. Didaktický materiál, príručka základných mikrobiologických postupov. Metropolitná autonómna univerzita. Oddelenie prírodných a technických vied. Cuajimalpa Unit. 2016. K dispozícii na adrese: cua.uam.mx/
5. Carbajal A. Bunkové kultivačné médiá: prehľad. Labome Svet laboratórií. University of Pittsburgh Medical Center, Spojené štáty americké. 2013 dostupné v: es /
6. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vydanie. Editorial Panamericana SA Argentína.
7. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentína.