MÜELLER HINTONOVÝ AGAR: ZÁKLAD, PRÍPRAVA A POUŽITIE - BIOLÓGIE - 2026

Mueller Hinton agar nie je selektívne, pevné živné prostredie sa skladá z mäsa infúzie, peptónu kyslého kazeínu, škrobu, agaru a destilovanou vodou. Toto médium umožňuje vynikajúci mikrobiálny rast pre najrýchlejšie rastúce baktérie.

Pôvodne ju vytvorili John Howard Müeller a Jane Hinton na izoláciu nutrične náročných baktérií, ako sú Neisseria gonorrhoeae a Neisseria meningitidis. Ukázalo sa však, že je vďaka svojim vlastnostiam ideálny na štúdium náchylnosti na antibiotiká a poskytuje spoľahlivé a reprodukovateľné výsledky.

Antibiogramy (Müeller Hintonov agar). Zdroj: Dr Graham Beards na en.wikipedia

Preto je Müeller Hinton Agar kultivačným médiom akceptovaným Inštitútom klinických a laboratórnych štandardov (CLSI) a Európskym výborom pre testovanie antimikrobiálnej citlivosti na vykonanie testu na antimikrobiálnu citlivosť metódou difúzie diskov Kirby. Bauer.

základ

Ako neselektívne výživné médium je vynikajúci pre rast väčšiny patogénnych baktérií.

Na druhej strane jeho jednoduché zloženie umožňuje ľahkú difúziu látok, čo je podstatnou charakteristikou testu citlivosti diskovou difúznou metódou.

Ďalšou z jeho charakteristík je, že obsahuje malé množstvo inhibítorov, čo umožňuje efektívne vyhodnotenie sulfonamidov, trimetoprimu a tetracyklínov.

Malo by sa však pamätať na to, že médium musí spĺňať určité podmienky, aby sa zabezpečilo jeho riadne fungovanie, vrátane:

Úprava pH, hĺbka agaru a vhodná koncentrácia tymínu, tymidínu, Ca ⁺⁺ , Mg ⁺⁺ a Zn ⁺⁺ .

Musíte tiež vedieť, že metodika je štandardizovaná, a preto musia byť splnené všetky parametre, ako napríklad:

Koncentrácia inokula, koncentrácia a konzervácia antibiotických diskov, umiestnenie vhodného počtu diskov na agar, vzdialenosť medzi jedným diskom a druhým, strategické umiestnenie určitých antibiotík, atmosféra, teplota a čas inkubácie.

príprava

Odváži sa 37 g dehydratovaného média Müeller Hinton a rozpustí sa v 1 litri destilovanej vody. Médium sa za stáleho miešania zahrieva, aby sa napomohlo rozpusteniu. Varte 1 minútu.

Autokláv sa sterilizuje pri 121 ° C počas 15 minút. Pri vyberaní z autoklávu by sa banka mala umiestniť do vodného kúpeľa pri 50 ° C, aby vychladla. Nalejte 25 až 30 ml do sterilných Petriho misiek s priemerom 10 cm.

Dosky by mali mať priemernú hrúbku 4 mm (ideálne), pričom je povolený rozsah 3-5 mm.

Ak je potrebné pripraviť krvný agar s použitím Müeller Hintonovho agaru ako základu, pred podaním na misky nalejte 5% sterilnú a defibrinovanú jahňaciu krv.

Konečné pH média by malo byť medzi 7,2 a 7,4.

Investujte a skladujte v chladničke až do použitia. Pred použitím nechajte platňu zohriať na izbovú teplotu.

Farba pripraveného média je svetlo béžová.

aplikácia

Používa sa na vykonanie testu antibiogramu alebo antibiotickej citlivosti pre najrýchlejšie rastúce nenáročné patogény.

Ak je agar doplnený krvou, používa sa okrem iného na antibiogram náročných mikroorganizmov, ako sú: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis. Používa sa tiež na izoláciu Legionella pneumophila.

Antibiogramová technika

Pred vykonaním antibiogramu sa musí pripraviť bakteriálny roztok rovnajúci sa 1,5 x ¹⁰⁸ buniek.

Za týmto účelom sa odoberú 3 až 4 kolónie čistej kultúry a suspendujú sa v sójovom tryptikázovom bujóne alebo v bujóne Müeller Hinton, inkubujú sa 2 až 6 hodín a koncentrácia sa upraví sterilným soľným roztokom a porovná sa so štandardom Mac Farland. 0,5%.

Ak požadujú mikroorganizmy, kolónie sa môžu suspendovať priamo do koncentrácie 0,5% Mac Farland. Následne sa doska Müeller Hinton naočkuje tampónom napusteným pripraveným bakteriálnym roztokom.

Za týmto účelom sa tampón ponorí do roztoku a potom sa prebytočná kvapalina odstráni pritlačením na steny skúmavky. Ihneď potom tampón prechádza cez celý povrch a nezanecháva žiadne miesta nedotknuté, potom sa doska mierne otočí a znova sa naočkuje. Operácia sa opakuje ešte dvakrát.

Nechajte stáť 10 minút a potom vložte antibiotické disky sterilnými klieštikmi, medzi nimi nechajte medzeru 24 mm. Po umiestnení každého disku na agar jemne pritlačte každý disk pomocou klieští, aby ste sa uistili, že dobre priľnú.

Po dokončení procesu sa doštička prevráti a inkubuje sa pri aerobióze pri teplote 35 - 37 ° C počas 16 až 18 hodín. Ak je to náročný mikroorganizmus, môže si zaslúžiť mikroaerofíliu a ak antibiogram obsahuje oxacilínové disky, mali by sa odčítať po 24 hodinách.

Na meranie priemeru každého halogénu sa používa pravítko. Výsledky by sa mali zaznamenať v mm. Získané hodnoty sa následne porovnajú s tabuľkami medzných bodov uverejnenými v súčasnej príručke CLSI.

Meranie inhibičného halo. Zdroj: USCDCP, Pixnio.com

Oznámte ako citlivé (S), stredné (I) alebo rezistentné (R).

Antibiotiká sa vyberajú podľa izolovaného mikroorganizmu a typu infekcie, ktorú spôsobuje.

Niekedy je potrebné mať na pamäti strategické umiestnenie antibiotík, aby sa odhalili fenotypové vzorce rezistencie.

Umiestnenie strategického disku na agar Müeller Hinton

Pri enterobaktériách by sa mal disk kyseliny klavulanovej umiestniť proti cefalosporínom 3. a 4. generácie. Rozšírenie v tvare vajíčka naznačuje, že kmeň je producentom beta-laktamáz s rozšíreným spektrom (ESBL). To znamená, že pacient by nemal byť liečený žiadnymi cefalosporínmi.

Fenotypová expresia produkcie beta-laktamázy s rozšíreným spektrom (ESBL) v kmeni Escherichia coli. Zdroj: Fotografia zhotovená autorom MSc. Marielsa gil

V Staphylococcus je dôležité umiestniť disk erytromycín alebo azitromycín pred clindamycínový disk (D-test).

Rezistentný halogén v erytromycíne a sploštenie v halogéne klindamycínu naznačuje, že kmeň má kmeňom indukovateľnú rezistenciu na klindamycín (ICR). To znamená, že liečba klindamycínom nebude účinná.

Na hľadanie indukovateľných kmeňov AMP C v Enterobacteriaceae a niektorých nefermentujúcich gramnegatívnych tyčiniek sú tazobaktánové ceftazidímy, cefoxitínové alebo piperacilínové disky orientované proti disku imipenému vo vzdialenosti 27 mm.

Sploštený halogén na jednom z diskov smerujúcich k imipenému ukazuje na prítomnosť indukovateľného AMP C.

Pri hľadaní konštitutívneho C-AMP sa 500 pg cloxacilínového disku čelí ceftazidímu (30 ug) a cefotaxímu (30 ug) vo vzdialenosti 25 mm. Rozšírený halo v ktoromkoľvek z cefalosporínov naznačuje pozitivitu.

Kloxacilínový disk sa môže tiež nahradiť 9 mm kotúčom filtračného papiera Whatman č. 6 impregnovaného fenylboritou kyselinou (400 ug) so vzdialenosťou 18 mm. Je interpretovaný rovnako ako predchádzajúci.

Nakoniec sa na výskum výroby metaloketalaktamáz, najmä v Pseudomonas aeruginosa, používa disk impregnovaný 10 ul kyseliny etyléndiamíntetraoctovej (EDTA 750 µg) a kyseliny tioglykolovej (SMA 300 µg), ktorá je konfrontovaná s diskami imipenému a meropenému, vo vzdialenosti 15 mm.

Test je pozitívny, ak sa rozširujú imipenemové alebo meropenemové halogény smerom k disku EDTA / SMA. Tento výsledok musí byť potvrdený modifikovaným Hodgeovým testom.

Táto metóda spočíva v naočkovaní kmeňa Escherichia coli ATCC 25922 na Müeller Hintonovu doštičku. Do stredu platne sa umiestni imipenemový disk a potom sa z disku na perifériu vytvorí pruh s podozrením na kmeň P. aeruginosa. Na doštičku je možné testovať až 4 kmene.

Test bude pozitívny, ak je okolo značky stretch zóna skreslenia imipenemového halo.

Príčiny chybných výsledkov

- Zle konzervované antibiotické disky môžu spôsobiť falošnú rezistenciu. Napríklad oxacilínový disk je veľmi citlivý na zmeny teploty.

- pH média pod uvedeným (kyslým) médiom produkuje menšie halogény v aminoglykozidoch a makrolidoch (riziko falošnej rezistencie) a väčšie halogény v penicilíne, tetracyklíne a novobiocíne (riziko falošnej citlivosti).

- Ak je pH vyššie ako uvedené (zásadité), účinky opísané vyššie sa zvrátia.

-Médiá s vysokými koncentráciami tymínu a tymidínu majú vplyv výrazným znížením inhibičných halogénov sulfónamidov a trimetoprimu.

- Vysoké koncentrácie vápnika a horčíka spôsobujú falošnú rezistenciu aminoglykozidov, polymyxínu B a tetracyklínov proti kmeňom Pseudomonas aeruginosa.

- Nízke koncentrácie vápnika a horčíka vyvolávajú falošné citlivosti aminoglykozidov, polymyxínu B a tetracyklínov proti kmeňom Pseudomonas aeruginosa.

- Prítomnosť zinku ovplyvňuje výsledky karbapenémových diskov (imipeném, meropeném a ertapeném).

- Hrúbka média pod 3 mm prinesie falošné výsledky citlivosti, zatiaľ čo hrúbka nad 5 prinesie falošnú rezistenciu.

- Mobilizácia diskov v antibiograme poskytne zdeformované halopy, pretože vypúšťanie antibiotík je okamžité.

- Veľmi slabé inokula ovplyvňujú výsledky, pretože nedôjde k rovnomernému alebo súvislému rastu v agare, čo je nevyhnutná podmienka na to, aby bolo možné zmerať inhibičné halogény, okrem skutočnosti, že halogény môžu byť väčšie ako normálne.

- Iba naložené očkovacie látky môžu dať halo menšie ako normálne.

- Nerešpektovanie vzdialenosti medzi diskami nespôsobí, že sa jeden halo prekrýva s druhým a nemôžu byť správne prečítané.

-Incubate s CO ₂ zväčšuje veľkosť halo efektov tetracyklínových a meticilínu diskov.

- Inkubácia pri teplotách pod 35 ° C vedie k väčším halogénom.

-Pridanie krvi zmenšuje veľkosť halosulfínu.

obmedzenia

Citlivosť antibiotika preukázaná v antibiograme proti mikroorganizmom (in vitro) nie je zárukou, že bude fungovať in vivo.

QA

Aby sa zistilo, či médium obsahuje dostatočné množstvo tymínu, musí sa vysadiť kmeň Enterococcus faecalis ATCC 29212 a musí sa testovať citlivosť na trimetoprim sulfametoxazol (SXT), aby bol uspokojivý, musí mať halo najmenej 20 mm.

Referencie

1. "Müller-Hintonov agar." Wikipedia, slobodná encyklopédia. 16. november 2018, 12:23 UTC. 27. januára 2019, 04:22
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentína.
3. Cona E. Podmienky pre dobrú štúdiu citlivosti agarovou difúznou skúškou. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
4. Laboratórium Difco Francisco Soria Melguizo. Müeller Hintonov agar s 5% ovčej krvi. 2009. Dostupné na: http://f-soria.es
5. Agarové laboratórium BD Müeller Hinton II. 2017. K dispozícii na: .bd.com
6. Britannia Laboratories. Müeller Hintonový agar. 2015.K dispozícii na: britanialab.com
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vydanie. Editorial Panamericana SA Argentína.
8. Martínez-Rojas D. Betalaktamázy typu AmpC: Všeobecnosti a metódy na fenotypovú detekciu. Soc. Ven. Microbiol. 2009; 29 (2): 78-83. K dispozícii na: scielo.org.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Fenotypová detekcia metalolobetalaktamáz v klinických izolátoch Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113 - 121. K dispozícii na: scielo.org.