REKOMBINANTNÁ DNA: TECHNIKA, APLIKÁCIE A ZÁKLADY - BIOLÓGIE - 2024

Rekombinantnej DNA (rDNA alebo rDNA) je umelá molekula nukleovej kyseliny vytvorené v laboratóriu, prostredníctvom integrácie dvoch segmentov záujmových organizácií. Vďaka svojej hybridnej vlastnosti je známa aj ako chimérická DNA. Tento druh DNA sa v prírode nenachádza.

Základná metodika na jej vytvorenie zahrnuje: a) výber cieľovej DNA a jej inzerciu do iného fragmentu DNA (všeobecne bakteriálneho plazmidu); b) zavedenie tohto plazmidu do baktérie, c) výber baktérií pomocou antibiotík a nakoniec d) expresia génu.

Zdroj: pixabay.com

Táto technika využíva rad enzýmov, ktoré umožňujú kopírovať a vkladať konkrétne fragmenty DNA podľa úsudku výskumného pracovníka.

Cieľom rekombinantnej technológie je vo väčšine prípadov expresia proteínu (známeho ako rekombinantný proteín), ktorý molekulárny biológ požaduje pre budúci výskum alebo aby sa vytvoril proteín s komerčnou a terapeutickou hodnotou - napríklad ľudský inzulín, napríklad.

Základy techniky rekombinantnej DNA a jej využitie v genetickom inžinierstve

Centrálna dogma molekulárnej biológie

Všetky organické bytosti, ktoré poznáme, majú niekoľko charakteristík. Jednou z nich je povaha genetického materiálu a spôsob výroby proteínov - proces známy ako centrálna „dogma“ molekulárnej biológie.

S výnimkou niekoľkých vírusov ukladajú všetky organizmy genetické informácie v DNA (kyselina deoxyribonukleová), zhromaždené veľmi kompaktným a usporiadaným spôsobom v jadre bunky.

Na génovú expresiu je molekula DNA transkribovaná do messengerovej RNA a táto je preložená do jazyka aminokyselín, stavebných blokov proteínov.

Čo je to rekombinantná DNA?

V 70. a 80. rokoch začali molekulárni biológovia využívať procesy, ktoré sa prirodzene vyskytujú vo vnútri bunky, a dokázali ich extrapolovať do laboratória.

Týmto spôsobom by sa do segmentu DNA z baktérie mohol vložiť gén živočíšneho pôvodu (napríklad stavovcov); alebo DNA baktérie môže byť kombinovaná s vírusovou DNA. Takto môžeme definovať rekombinantnú DNA ako molekulu vytvorenú z DNA z dvoch rôznych organizmov.

Po vytvorení tejto hybridnej alebo rekombinantnej molekuly sa exprimuje požadovaný gén. Slovným výrazom chceme odkazovať na proces translácie na proteín.

Reštrikčné enzýmy a ligázy: kľúč k procesu

Kľúčovým prvkom vo vývoji technológie rekombinantnej DNA bol objavenie reštrikčných enzýmov.

Sú to proteínové molekuly, ktoré vykazujú schopnosť štiepiť DNA (nukleázy) na špecifické sekvencie, ktoré slúžia ako „molekulárne nožnice“. Fragmenty generované týmito enzýmami sa nazývajú reštrikčné fragmenty.

Uvedené enzýmy môžu produkovať symetrické rezy v cieľovej sekvencii (v oboch reťazcoch v rovnakej výške) alebo asymetrické rezy. Kľúčovým aspektom pôsobenia reštrikčných enzýmov je to, že po štiepení reťazcov sa získa „voľný okraj“, ktorý je komplementárny s druhým okrajom rezaným rovnakým enzýmom.

Niektoré príklady sú ECOR 1 a Sma 1. V súčasnosti je známych a komerčne dostupných viac ako 200 typov reštrikčných enzýmov.

Nožnice musia byť doplnené lepidlom, aby boli užitočné. Tento tesniaci účinok DNA (predtým ošetrenej reštrikčnými enzýmami) sa uskutočňuje ligázami.

Technika: ako sa v laboratóriu umelo modifikuje DNA organizmu?

Ďalej popíšeme hlavné kroky, ktoré vyžaduje technológia rekombinantnej DNA. Všetky sú vykonávané odborníkmi v laboratóriu molekulárnej biológie.

Čo je to „klon“?

Predtým, ako budeme pokračovať v experimentálnom protokole, musíme si uvedomiť, že v molekulárnej biológii a biotechnológii sa často používajú pojmy „klon“ a sloveso „klon“. To by mohlo viesť k nejasnostiam.

V tejto súvislosti nehovoríme o klonovaní celého organizmu (napríklad v prípade slávnej ovce Dolly), ale o klonovaní časti DNA, ktorou môže byť gén. To znamená, že sa vytvorí veľa kópií - geneticky identických - sekvencie.

1. Izolácia a získanie DNA

Prvým krokom je rozhodnúť, ktorú sekvenciu chcete použiť. Závisí to výlučne od výskumného pracovníka a od cieľov jeho práce. Táto DNA sa potom musí izolovať a vyčistiť. Metódy a postupy na dosiahnutie tohto cieľa závisia od tela a tkaniva.

Spravidla sa odoberie kúsok tkaniva a podrobí sa spracovaniu v lyzačnom tlmivom roztoku s proteinázou K (proteolytický enzým) a potom sa extrahuje DNA. Následne sa genetický materiál rozdelí na malé fragmenty.

2. Klonovací vektor

Po prípravných krokoch sa výskumný pracovník snaží zaviesť požadovaný segment DNA do klonovacieho vektora. Od tejto chvíle budeme nazývať tento segment bielej DNA DNA.

plazmidy

Jeden z najpoužívanejších vektorov v plazmide bakteriálneho pôvodu. Plazmid je dvojvláknová molekula cirkulárnej DNA, ktorá sa prirodzene nachádza v baktériách. Sú cudzí bakteriálnemu chromozómu - to znamená, že sú extrachromozomálne a nachádzajú sa prirodzene v týchto prokaryotoch.

Základnými prvkami vektora sú: a) počiatok replikácie, ktorý umožňuje syntézu DNA; b) selekčné činidlo, ktoré umožňuje identifikáciu organizmov, ktoré nesú plazmid s cieľovou DNA, ako napríklad rezistencia na určité antibiotikum; a (c) multiklonovacie miesto, kde sa nachádzajú sekvencie, ktoré budú rozpoznávané reštrikčnými enzýmami.

Prvá úspešná rekombinantná DNA v laboratóriu bola klonovaná do plazmidu pSC101 z baktérie E. coli. Toto obsahuje okrem začiatku replikácie restrikčné miesto pre reštrikčný enzým EcoRI a gén pre rezistenciu na antibiotikum.

Vkladanie cieľovej DNA do plazmidu sa uskutočňuje pomocou molekulárnych nástrojov reštrikčných enzýmov a ligáz opísaných v predchádzajúcej časti.

Ostatné typy vektorov

Okrem plazmidov môže byť DNA vložená do iného vektora, ako je napríklad bakteriofág lambda, kozmidy, YAC (kvasinkové umelé chromozómy), BAC (bakteriálne umelé chromozómy) a fagemidy.

3. Zavedenie rekombinantnej DNA

Len čo sa získa rekombinantná molekula DNA (gén, o ktorý je záujem, v plazmide alebo inom vektore), zavedie sa do hostiteľského alebo hostiteľského organizmu, ktorým môže byť baktéria.

Na zavedenie cudzej DNA do baktérie sa používa technika nazývaná bakteriálna transformácia, pri ktorej je organizmus vystavený pôsobeniu dvojmocných katiónov, vďaka ktorým je náchylný na absorpciu DNA.

Metodicky nemôžeme zaručiť, že 100% baktérií v našej kultúre účinne prijalo našu molekulu rekombinantnej DNA. Tu prichádza do úvahy časť plazmidu, ktorý obsahuje rezistenciu na antibiotiká.

Baktérie, ktoré absorbovali plazmid, budú teda rezistentné na určité antibiotikum. Na ich výber stačí aplikovať uvedené antibiotikum a vziať pozostalých.

4. "Zber" proteínu

Po výbere baktérií s našou rekombinantnou DNA pokračujeme v použití enzymatického aparátu hostiteľa na vytvorenie požadovaného proteínového produktu. Keď sa baktérie množia, plazmid sa prenáša na svoje potomstvo, takže sa pri delení nestráca.

Tento postup používa baktérie ako druh bielkoviny „továrne“. Neskôr uvidíme, že to bol veľmi relevantný postup pri vývoji účinných liečebných postupov.

Akonáhle je kultúra pripravená a baktérie produkovali veľké množstvo proteínu, je bunka lyzovaná alebo narušená. Existuje široká škála biochemických techník, ktoré umožňujú čistenie proteínov podľa ich fyzikálno-chemických charakteristík.

V inom experimentálnom kontexte možno nebudeme mať záujem o vytvorenie proteínu, ale skôr o získanie sekvencie DNA per se. Ak by to tak bolo, plazmid by sa použil na vytvorenie viacerých kópií požadovaného fragmentu, aby bolo dosť cieľovej DNA na uskutočnenie príslušných experimentov.

aplikácia

Technológia rekombinantnej DNA otvorila nekonečné množstvo možností v molekulárnej biológii, biotechnológii, medicíne a ďalších súvisiacich oblastiach. Jeho najvýznamnejšie aplikácie sú nasledujúce.

Genetická analýza

Prvá aplikácia priamo súvisí s laboratóriami molekulárnej biológie. Technológia rekombinantnej DNA umožňuje vedcom porozumieť normálnej funkcii génov a generované proteíny sa môžu použiť v ďalšom výskume.

Farmaceutický priemysel

Proteíny produkované pomocou postupu rekombinantnej DNA majú použitie v medicíne. Dva veľmi dôležité príklady v tejto oblasti sú ľudský inzulín a rastový hormón, ktorý sa používa u pacientov, ktorým chýba tento proteín.

Vďaka rekombinantnej DNA môžu byť tieto proteíny generované bez potreby ich extrahovania z inej ľudskej bytosti, čo predstavuje ďalšie metodologické komplikácie a zdravotné riziká. To pomohlo zlepšiť kvalitu života pre nespočetné množstvo pacientov.

Referencie

1. Baca, LEL a Álvarez, CLC (2015). Biológia 2. Grupo Editorial Patria.
2. Cooper, GM, Hausman, RE a Hausman, RE (2000). Bunka: molekulárny prístup (zväzok 10). Washington, DC: ASM press.
3. Devlin, TM (2004). Biochémia: učebnica s klinickými aplikáciami. Obrátil som sa.
4. Khan, S., Ullah, MW, Siddique, R., Nabi, G., Manan, S., Yousaf, M., & Hou, H. (2016). Úloha technológie rekombinantnej DNA na zlepšenie života. Medzinárodný časopis genomiky, 2016, 2405954.
5. Mindán, FP, & Mindan, P. (1996). Patologická anatómia. Elsevier Španielsko.
6. Tortora, GJ, Funke, BR, a Case, CL (2007). Úvod do mikrobiológie. Panamerican Medical Ed.
7. The, MJ (1989). Ľudský inzulín: prvé liečivo technológie DNA. American Journal of Health-System Pharmacy, 46 (11_suppl), S9-S11.