VYSOKOÚČINNÁ KVAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIA (HPLC): ZDÔVODNENIE, VYBAVENIE, TYPY - CHÉMIA - 2026

HPLC je inštrumentálne technika používaná v chemických analýz, ktoré oddelené zmesi sa môžu, očistiť a kvantifikovať jeho zložiek, a ďalšie štúdie. Je známa skratkou HPLC, odvodenou z angličtiny: High Performance Liquid Chromatography.

Ako už názov napovedá, funguje tak, že manipuluje s tekutinami. Tieto pozostávajú zo zmesi zloženej z analyzovanej látky alebo vzorky a jedného alebo viacerých rozpúšťadiel, ktoré pôsobia ako mobilná fáza; to znamená ten, ktorý vtiahne analyt cez celé HPLC zariadenie a kolónu.

Zariadenie HPLC. Zdroj: Dqwyy

Laboratóriá na analýzu kvality v mnohých spoločnostiach bežne používajú HPLC. ako sú liečivá a potraviny. Príslušný analytik musí pripraviť vzorku, mobilnú fázu, skontrolovať teplotu a ďalšie parametre a vložiť liekovky do kolesa alebo karuselu, aby zariadenie mohlo automaticky vykonávať injekcie.

Zariadenie HPLC je pripojené k počítaču, cez ktorý je možné pozorovať vytvorené chromatogramy, ako aj na začatie analýz, riadenie toku mobilnej fázy, programovanie typu elúcie (izokratický alebo gradientový) a zapnutie detektorov (UV) -Vis alebo hmotnostný spektrofotometer).

základ

Na rozdiel od konvenčnej kvapalinovej chromatografie, ako je stĺpcová chromatografia naplnená papierom alebo silikagélom, HPLC nezávisí od gravitácie, aby kvapalina zvlhčila stacionárnu fázu. Namiesto toho pracuje s vysokotlakovými čerpadlami, ktoré zavlažujú mobilnú fázu alebo eluent cez kolónu s väčšou intenzitou.

Týmto spôsobom nie je potrebné nalievať mobilnú fázu tak často cez stĺpec, ale systém to robí kontinuálne as vyššími prietokmi.

Účinnosť tejto techniky však nie je spôsobená výlučne týmto detailom, ale tiež malými časticami plniva, ktoré tvoria stacionárnu fázu. Keďže je menšia, jej kontaktná plocha s mobilnou fázou je väčšia, takže bude lepšie interagovať s analytom a jeho molekuly sa budú viac separovať.

Tieto dve vlastnosti, plus skutočnosť, že táto technika umožňuje spojenie detektorov, robí z HPLC oveľa lepšiu chromatografiu na tenkej vrstve alebo na papieri. Separácie sú efektívnejšie, mobilná fáza cestuje lepšie cez stacionárnu fázu a chromatogramy môžu zistiť akúkoľvek chybu v analýze.

zariadenie

Zjednodušená schéma činnosti zariadenia HPLC. Zdroj: Gabriel Bolívar.

Hore je zjednodušená schéma fungovania zariadenia HPLC. Rozpúšťadlá sú vo svojich príslušných nádobách usporiadané s hadicami tak, aby ich čerpadlo čerpalo malý objem do zariadenia; máme teda mobilnú fázu.

Mobilná fáza alebo eluent musia byť najskôr odplynené tak, aby bubliny neovplyvňovali separáciu molekúl analytu, ktorá sa zmieša s mobilnou fázou, keď zariadenie vstrekne injekciu.

Chromatografická kolóna je umiestnená vo vnútri rúry, ktorá umožňuje regulovať teplotu. Preto pre rôzne vzorky existujú dostatočné teploty na dosiahnutie vysokoúčinných separácií, ako aj široký katalóg stĺpcov a typov náplní alebo stacionárnych fáz pre špecifickú analýzu.

Mobilná fáza s rozpusteným analytom vstupuje do kolóny az nej sa najskôr eluujú molekuly, ktoré „pociťujú“ nižšiu afinitu pre stacionárnu fázu, zatiaľ čo tie, ktoré sú viac zadržané, sa eluujú neskôr. Každá eluovaná molekula generuje signál zobrazený na chromatograme, kde sú pozorované retenčné časy separovaných molekúl.

A na druhej strane mobilná fáza po prejdení detektorom končí v nádobe na odpad.

Typy HPLC

Existuje veľa druhov HPLC, ale spomedzi všetkých najvýznamnejších sú nasledujúce štyri.

Chromatografia v normálnej fáze

Chromatografia v normálnej fáze znamená chromatografiu, pri ktorej je stacionárna fáza polárnej povahy, zatiaľ čo mobilná fáza je nepolárna. Aj keď sa to nazýva normálne, v skutočnosti je najmenej používané, s najrozšírenejšou a najúčinnejšou reverznou fázou.

Chromatografia na reverznej fáze

Ako inverzná fáza je teraz stacionárna fáza nepolárna a mobilná fáza je polárna. Toto je užitočné najmä v biochemickej analýze, pretože veľa biomolekúl sa lepšie rozpúšťa vo vode a v polárnych rozpúšťadlách.

Iónomeničová chromatografia

Pri tomto type chromatografie sa analyt s kladným alebo záporným nábojom pohybuje v kolóne a nahrádza ióny, ktoré obsahuje. Čím vyšší je náboj, tým vyššia je jeho retencia, a preto sa bežne používa na oddelenie iónových komplexov prechodných kovov.

Chromatografia s vylúčením podľa veľkosti

Táto chromatografia, skôr než separácia, je zodpovedná za čistenie výslednej zmesi. Ako naznačuje jeho názov, analyt sa už neoddeľuje v závislosti od toho, ako úzko súvisí so stacionárnou fázou, ale podľa veľkosti a molekulovej hmotnosti.

Menšie molekuly sa zadržia viac ako veľké molekuly, pretože tieto molekuly nie sú zachytené medzi pórmi náplne polymérneho stĺpca.

aplikácia

HPLC umožňuje kvalitatívnu aj kvantitatívnu analýzu. Z kvalitatívneho hľadiska je možné pomocou porovnania retenčných časov chromatogramu za určitých podmienok zistiť prítomnosť konkrétnej zlúčeniny. Takáto prítomnosť môže naznačovať ochorenie, falšovanie alebo užívanie drog.

Preto je počítačovou súčasťou diagnostických laboratórií. Podobne sa vyskytuje vo farmaceutickom priemysle, pretože umožňuje kontrolovať čistotu produktu, ako aj jeho kvalitu vzhľadom na jeho rozpúšťanie v žalúdočnom prostredí. Východiskové materiály sa tiež podrobia HPLC, aby sa vyčistili a zaistili lepšie výsledky pri syntéze liečiv.

HPLC umožňuje analýzu a separáciu komplexných zmesí proteínov, aminokyselín, uhľohydrátov, lipidov, porfyrínov, terpenoidov a je v podstate vynikajúcou možnosťou pre prácu s rastlinnými extraktmi.

A nakoniec, molekulárna vylučovacia chromatografia umožňuje výber polymérov rôznych veľkostí, pretože niektoré môžu byť menšie alebo väčšie ako iné. Týmto spôsobom sa získajú produkty s nízkou alebo vysokou priemernou molekulovou hmotnosťou, čo je určujúcim faktorom ich vlastností a budúcich aplikácií alebo syntézy.

Referencie

1. Day, R., & Underwood, A. (1989). Kvantitatívna analytická chémia. (piate vydanie). PEARSON Prentice Hall.
2. Bussi Juan. (2007). Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia. , Získané z: fing.edu.uy
3. Wikipedia. (2019). Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia. Obnovené z: en.wikipedia.org
4. Clark Jim. (2007). Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia. Získané z: chemguide.co.uk
5. Matthew Barkovich. (05. decembra 2019). Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia. Chémia LibreTexts. Obnovené z: chem.libretexts.org
6. GP Thomas. (15. apríla 2013). Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) - metódy, výhody a aplikácie. Obnovené z: azom.com