ENZÝMOVÁ AKTIVITA: JEDNOTKA, MERANIE, REGULÁCIA A FAKTORY - CHÉMIA - 2026

Enzymatická aktivita je spôsob, ako vyjadriť množstvo enzýmu prítomného v danom čase. Označuje množstvo substrátu transformovaného na produkt katalytickým pôsobením enzýmu na jednotku času.

Je ovplyvnená podmienkami, za ktorých prebieha enzymatická reakcia, a preto sa zvyčajne vzťahuje na teplotu, pri ktorej sa meria. Čo sú to enzýmy? Sú to biologické katalyzátory, ktoré sú schopné urýchliť rýchlosť reakcie bez toho, aby počas katalyzovaného procesu došlo k nezvratnej zmene.

Ananás alebo ananás, ovocie, ktoré obsahuje enzým bromelaín, a preto vykazuje vysokú enzymatickú aktivitu Zdroj: H. Zell

Enzýmy sú vo všeobecnosti proteíny s výnimkou ribozómov, molekuly RNA s enzymatickou aktivitou.

Enzýmy zvyšujú rýchlosť reakcie znížením energetickej bariéry (aktivačná energia); musí uplynúť doba, aby sa dosiahol prechodný stav, a teda k reakcii.

Molekuly substrátu, ktoré dosiahnu prechodný stav, podliehajú štrukturálnym zmenám, ktoré ich vedú k vzniku molekúl produktu. Na základe funkcií, ktoré plnia, sú enzýmy rozdelené do šiestich veľkých skupín: oxyreduktázy, transferázy, hydrolázy, lyázy, izomerázy a ligázy.

Enzýmy bromelaín a papaín sú napríklad proteolytické enzýmy (hydrolázy) nachádzajúce sa v ananáse alebo v ananáse, respektíve papája alebo papája.

Je známe, že ananás aj papája uľahčujú tráviaci proces, pretože pôsobením proteolytických enzýmov, ktoré obsahujú, pomáhajú tráviť proteíny, to znamená z mäsa a zŕn.

Jednotka enzýmovej aktivity

Enzymatická jednotka (IU) je množstvo enzýmu, ktoré katalyzuje transformáciu 1 umol substrátu za minútu.

Neskôr Medzinárodný systém jednotiek (SI) definoval jednotku enzýmovej aktivity ako množstvo enzýmu, ktoré premení 1 mól substrátu na produkt za sekundu. Táto jednotka dostala meno katal (kat).

1 mol = 10 ⁶ umol a 1 minúta = 60 sekúnd.

Preto 1 katal sa rovná 60 x 10 ⁶ IU. Pretože katal je veľká jednotka, často sa používajú menšie jednotky, ako napríklad: mikrokatál (μkat), ^10-6 katal a nanokatál (πkat), ^10-9 katal.

Špecifická činnosť

Je to počet jednotiek enzýmovej aktivity vydelený miligramami proteínu v testovanej vzorke. Špecifická aktivita priamo súvisí so stupňom purifikácie enzýmu.

Ako sa meria enzýmová aktivita?

Existuje niekoľko spôsobov stanovenia aktivity enzýmu. Výber konkrétneho spôsobu bude závisieť od cieľa enzýmového testu; uplatniteľnosť metódy; prístup k zariadeniu nevyhnutnému na vykonanie experimentu; náklady na použitie konkrétnej metódy atď.

Existujú spektrofotometrické, fluorometrické, chemiluminiscenčné, kalorimetrické, rádiometrické a chromatografické metódy.

Spektrofotometrické metódy môžu byť kolorimetrické a odčítané v ultrafialovej (UV) oblasti elektromagnetického žiarenia.

- kolorimetrická metóda

Je založená na tvorbe chromoforu enzymatickým pôsobením. Enzymatickú aktivitu je možné sledovať kontinuálne alebo diskontinuálne.

Nepretržitá forma

V kontinuálnej forme sú činidlá umiestnené do kyvety v spektrofotometri pri požadovanej vlnovej dĺžke, ktorá zodpovedá tej, pri ktorej má chromofor maximálnu hodnotu optickej hustoty; a že okrem toho nedochádza k interferencii s inou látkou, ktorá sa môže vytvárať.

Enzymatická reakcia sa iniciuje pridaním vzorky obsahujúcej enzým, ktorej aktivita sa má určiť. Súčasne sa spustia stopky a čas od času sa zaznamená hodnota optickej hustoty.

Pretože je známa ekvivalencia optickej hustoty s mólmi substrátu alebo produktom enzymatického pôsobenia, v závislosti od použitej techniky je možné vypočítať móly spotrebovaného substrátu alebo vyrobené móly.

Ďalej, pretože sa meral uplynutý čas enzymatickej reakcie, je možné získať móly spotrebované alebo vyrobené za sekundu. Enzymatická aktivita je teda stanovená v katálových jednotkách.

Nespojitý tvar

V dávkovej forme na stanovenie enzymatickej aktivity sa skúmavky so zložkami reakcie, s výnimkou vzorky obsahujúcej enzým alebo inú zložku, umiestnia do kúpeľa s teplotou 37 ° C. Reakcia sa potom začne pridaním chýbajúcej zložky.

Čas uvedený technikou sa nechá nastať a reakcia sa ukončí pridaním zlúčeniny, ktorá zastaví reakciu. Optická hustota sa odčíta v tom čase a nakoniec sa rovnakým spôsobom ako kontinuálnym spôsobom stanoví enzymatická aktivita.

- Spôsob merania v ultrafialovom svetle

Napríklad koenzým nikotínamidadinukleotid má dve formy: NADH (redukovaný) a NAD ⁺ (oxidovaný). Podobne má koenzým nikotínamityinukleotidfosfát dve formy NADPH a NADP ⁺ , redukované a oxidované.

Redukovaná aj oxidovaná forma koenzýmu sa odčítavajú v ultrafialovom svetle v dĺžke 260 nm; medzitým sa od ultrafialového svetla odčítajú iba redukované formy v dĺžke 340 nm.

Preto sa pri oxidačných alebo redukčných reakciách, na ktorých sa zúčastňujú uvedené koenzýmy, odčítavajú pri 340 nm.

Stanovenie enzymatickej aktivity je v podstate rovnaké ako stanovenie v kontinuálnej forme kolorimetrickej metódy; okrem toho, že sa odčítava optická hustota pri 340 nm na pozorovanie tvorby NADH alebo NADPH alebo na meranie spotreby týchto koenzýmov.

Závisí to od toho, či je nameranou reakciou oxidácia alebo redukcia. Prostredníctvom korešpondencie medzi optickou hustotou a mólami NADH a NADPH môže byť enzymatická aktivita vypočítaná vydelením mólov koenzýmu uplynutým časom v sekundách.

Regulácia enzýmovej aktivity

Kontrola na úrovni substrátu alebo produktu

Keď sa koncentrácia substrátu zvyšuje, zvyšuje sa enzymatická aktivita. Ale pri určitej koncentrácii substrátu je aktívne miesto alebo aktívne miesta enzýmu nasýtené, takže aktivita enzýmu sa stáva konštantnou.

Produkt enzymatického pôsobenia však môže tiež interagovať s aktívnymi miestami enzýmu, čo vedie k inhibícii enzymatickej aktivity.

Produkt môže pôsobiť ako konkurenčný inhibítor; môže sa napríklad uviesť enzým hexokináza. Tento enzým produkuje fosforyláciu glukózy, čo vedie k vzniku glukózy-6-fosfátu, zlúčeniny, ktorá po akumulácii inhibuje hexokinázu.

Kontrola spätnej väzby

Môže sa stať, že skupina enzýmov (A, B, C, D, E a F) účinkuje postupne v metabolickej ceste. Enzým B používa produkt enzýmu A ako substrát atď.

Bunka môže v závislosti od svojich metabolických požiadaviek aktivovať alebo inhibovať sekvencie enzymatických aktivít. Napríklad akumulácia produktu enzýmu F môže pôsobiť tak, že inhibuje enzým A alebo akýkoľvek iný enzým v sekvencii.

Allosterické enzýmy

Enzým sa môže skladať z niekoľkých podjednotiek, z ktorých každá má svoje príslušné aktívne miesta. Tieto podjednotky však nekonajú nezávisle, takže aktivita jednej z podjednotiek môže aktivovať alebo inhibovať činnosť zvyšku.

Aj keď sa hemoglobín nepovažuje za enzým, je to vynikajúci model pre jav alosterizmu. Hemoglobín je tvorený štyrmi proteínovými reťazcami, dvoma a reťazcami a dvoma p reťazcami, z ktorých každý je pripojený k skupine s hem.

Medzi podjednotkami sa môžu vyskytnúť dva javy: homoalosterizmus a heteroalosterizmus.

Homoalosterism

Väzba substrátu k jednej z podjednotiek zvyšuje afinitu ostatných podjednotiek pre substrát, čo zase zvyšuje enzymatickú aktivitu každej zo zvyšných podjednotiek.

Podobne inhibícia enzymatickej aktivity v jednej z podjednotiek vyvoláva rovnaký účinok vo zvyšku.

V prípade hemoglobínu bude väzba kyslíka na hemovú skupinu jedného z proteínových reťazcov spôsobovať zvýšenie avidity kyslíka v zostávajúcich reťazcoch.

Podobne uvoľňovanie kyslíka zo skupiny hémov spôsobuje uvoľňovanie kyslíka zo zostávajúcich skupín proteínových reťazcov.

Heterolosterism

Väzba aktivačnej alebo inhibičnej látky inej ako substrát na jednu z podjednotiek spôsobí aktiváciu alebo inhibíciu enzymatickej aktivity v ďalších podjednotkách.

V prípade hemoglobínu, väzbu na heme skupine H ⁺ , CO ₂ a 2,3-diphosphoglycerate k jednému z podjednotiek, znižuje afinitu heme skupiny pre kyslík, čo spôsobuje jeho uvoľňovanie. Toto uvoľňovanie kyslíka je tiež produkované v ďalších reťazcoch hemoglobínu.

Faktory ovplyvňujúce enzýmovú aktivitu

- Koncentrácia substrátu

So zvyšujúcou sa koncentráciou substrátu sa zvyšuje aj enzýmová aktivita. Je to kvôli zvýšenému prístupu molekúl substrátu k aktívnym miestam enzýmu.

Ale pre danú koncentráciu substrátu sú všetky aktívne miesta enzýmu s ním nasýtené, čo spôsobuje, že enzymatická aktivita sa nezvýši, aj keď sa koncentrácia substrátu zvýši.

-pH z enzymatickej reakcie

Enzýmy majú optimálne pH, pri ktorom je afinita enzýmu k substrátu najvyššia. Pri tomto pH sa dosiahne maximálna hodnota enzymatickej aktivity.

Nadmerná kyslosť alebo zásaditosť média môže spôsobiť denaturáciu enzýmu, čo následne znižuje jeho aktivitu.

Profil pH enzýmovej aktivity je rôzny. Napríklad pepsín má maximálnu aktivitu medzi 1 až 2 jednotkami pH; trypsín má optimálne pH 8; a papaín má konštantnú aktivitu medzi rozsahom pH medzi 4 a 8.

- Teplota enzymatickej reakcie

Enzýmová aktivita sa zvyšuje so zvyšujúcou sa teplotou. Všeobecne sa aktivita enzýmu zdvojnásobí na každých 10 stupňov zvýšenia, až kým sa nedosiahne optimálna teplota pre aktivitu enzýmu.

Keď sa však prekročí optimálna teplota, má enzýmová aktivita tendenciu klesať so zvyšujúcou sa teplotou reakcie. Je to spôsobené skutočnosťou, že proteíny, a teda enzýmy, podliehajú denaturácii v dôsledku nadmerného zvýšenia teploty.

- iónová koncentrácia reakcie

Enzýmy majú všeobecne optimálnu aktivitu v koncentračnom rozmedzí od 0 do 500 mmol / l. Avšak pri vyšších koncentráciách má enzýmová aktivita tendenciu klesať.

Za týchto okolností sú blokované určité iónové interakcie v enzýmoch, potrebné pre ich maximálnu aktivitu.

Referencie

1. Segel, IH (1975). Biochemické výpočty. ( ^2. vydanie). John Wiley & Sons, INC
2. Lehninger, AL (1975). Biochémie. ( ^2. vydanie). Worth Publishers, inc.
3. Mathews, CK, van Holde, KE a Ahern, KG (2002). Biochémie. (3 ^ra Edition). Pearson Addison Weshley.
4. Wikipedia. (2019). Enzýmová skúška. Obnovené z: en.wikipedia.org
5. González Juan Manuel. (SF). Kinetický enzým. Kurz biomolekúl. Získané z: ehu.eus